最近有童鞋在後臺留言「質粒是誰？它來自哪裡？它要去哪兒？」，對質粒圖譜無法正確讀取。
誠然，這種感覺就好比小師妹整天嚷嚷著「皮皮蝦，我們走」「皮皮蝦所不能承受之重」，鬥圖鬥得可溜了，結果昨晚真的請她去吃皮皮蝦了，第一次見到皮皮蝦的她被嚇得一個勁兒地往角落裡躲，知其然不知其所以然！
正好X溼兄對質粒略知一二，開啟你的寫輪眼，一起來了解一下質粒的前世今生吧。
一、分子遺傳學的起源—質粒
「如果孟德爾的豌豆實驗標誌著基因概念的誕生，那麼質粒載體的發現則象徵著分子遺傳學的起源。」這句話對質粒的讚美其實是毫不誇張的。
孟德爾的豌豆實驗之後的100年時間裡，越來越多有意義的生物實驗證明：基因編輯了蛋白，而且基因就依附在染色體上。染色體就是遺傳信息DNA，DNA藉由轉錄本RNA翻譯為蛋白質，行使功能，這就是中心法則（Central Dogma）。
但其實不然，有些基因信息還可以存在於染色體外，1952年Joshua Lederberg創造一個詞兒「質粒(Plasmid)」，指的是任何染色體外的遺傳決定物質，共價、閉合、環狀雙鏈DNA（cccDNA），大小從1kb~1000kb。質粒是一種獨立於染色體外獨立複製的雙鏈DNA片段，通常都含有基因。儘管質粒在細菌、古細菌和真核細胞中都有發現，但質粒對於細菌的生物學意義更加重要，因為細菌與細菌之間可以通過鞭毛等相互交換質粒信息，而這種遺傳信息的交換是有利的，因為質粒上面含有耐藥基因等信息。不過別人的遺傳信息不要輕易接收，除非有下圖的功能。
腰不酸了腿也不疼了走路也有勁了
上世紀70年代，限制內切酶、DNA連接酶和凝膠電泳實驗讓特定的DNA片段從染色體上轉移到質粒載體上來研究功能成為可能，這個過程叫「分子克隆」。分子克隆的過程允許科學家們將染色體斷裂，單獨研究它們的基因，這標誌著分子遺傳學的誕生。分子克隆有點像《火影忍者》裡的寫輪眼，寫輪眼好比基因，眼睛的受體好比質粒，既挖即裝即生效，也不排斥，生物學家的掌中寶。
二、質粒減肥史—玉不琢不成器
天然存在的野生型質粒分子量大(＞15kb)、拷貝數低、單一酶切位點少、遺傳標記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求。你想像一下，萬米跑中，一個從來不跑步、卻穿著皮鞋的400斤大胖子，和一個訓練有素、跑步裝備適宜的小瘦子，哪個跑第一的可能性更大一點？（沒有歧視胖子的意思，別打我，打人也別打臉）
天然質粒改造過程
那麼如何讓這個大胖子跑第一呢？那就是改造！首先得讓這個大胖子減肥，把多餘的肥肉減下來到合適的體重；然後給他提供一整套合適的跑步裝備，周而復始地訓練。同樣的道理，質粒必須改造才能成為生物學家的工具：
①減肥，把多餘的和功能研究無關的片段刪除掉，15kb→1~5kb
②給它合適的裝備，安裝各種酶切位點以及遺傳標記，例如抗性基因（氨苄黴素、卡那黴素、四環素…）、報告基因（luciferase、EGFP…）等。
這樣改造後的質粒才是咱們平常實驗室的質粒載體，用起來就溜了。
玉不琢不成器
三、質粒載體在科研中的用途—八仙過海各顯神通
① 克隆載體：能帶動外源基因，在宿主細胞中複製擴增。它是用來克隆和擴增DNA片段（基因）的載體，這類載體沒有啟動子等啟動轉錄、翻譯的元件。
② 表達載體：具有克隆載體的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）還具有轉錄/翻譯所必需的DNA序列。(X溼兄以前用過pET系列的表達過蛋白質並純化， pET表達載體系列使用了T7啟動子，對於蛋白的表達特別強烈，宿主菌的70%的資源都被調用來生產目的蛋白，有時候也挺心疼宿主細胞的，X溼兄覺得對不起這些宿主菌了，想想這些宿主菌除了保證自己的基本性命之外，一直在幹活。。。。。。這也是為何生產蛋白的企業喜歡pET系列載體的原因，每升的培養基可產出幾克的目的蛋白。)
被轉染了質粒的細胞，像極了加班中的你
③ 基因下調載體：用於減少某個內源基因的表達，該載體上含有針對目標基因mRNA的shRNA，起到基因沉默的作用，下調基因的蛋白表達。
④ 病毒質粒：基於病毒的基因組改造而成的質粒，可以獨立包裝成為病毒顆粒，巧妙地去除了病毒的感染致病性卻保留了病毒的其他功能，為功能基因的靈活進入細胞並整合到基因組中提供了非常方便的工具。
四、質粒載體的正確解讀—寫輪眼開啟
質粒的命名：舉個慄子，pUC19、pEGFP-N3。小寫字母p代表質粒」plasmid」，2~4個大寫字母代表發明者、實驗室名稱或者其他表型性狀（EGFP是增強型綠色螢光蛋白）。
質粒圖譜的解讀：
① 複製起始位點Ori，了解質粒的類型（原核/真核/穿梭質粒）：招募複製蛋白，進行質粒的自我複製，增加拷貝數，隨著細胞的增殖而增殖；
② 抗性基因：有些童鞋會問為何要往培養基裡面加抗生素？質粒為何要有抗性基因？因為質粒對於一般細胞來講不是必需元件，在沒有抗生素的培養基中不斷增殖的過程中，質粒載體慢慢就丟失了，只有培養基裡面加入抗生素，抗性基因賦予宿主菌分解抗生素的能力，細胞才會需要該質粒。
這就好比在和平年代，武器不被需要，但是上戰場就得拔槍射殺敵人保護自己的道理一樣，這質粒就相當於是機槍，給予細胞在抗生素環境中存活下來的條件。這樣咱們研究的功能基因才能夠在每個細胞中存在。
③ 看多克隆位點（MCS）：它具有多個限制內切酶的單一切點（質粒上只能有該內切酶的唯一酶切序列，不然就一刀好幾段了），便於咱們要研究的基因的插入。如果在這些位點外有外源基因的插入，會導致某種標誌基因的失活，而便於篩選，最常見的是β-半乳糖苷酶的藍白斑篩選系統（自行百度百科）。
如果某個內切酶的酶切序列有好幾個，會被亂刀砍成好幾段的
④ 是否含有表達系統元件，即啟動子（promoter）－核糖體結合位點（RBS）－轉錄終止信號（AATAAA同時是poly A）。這是用來區別克隆載體與表達載體。克隆載體中加入一些與表達調控有關的元件即成為表達載體。選用那種載體，還是要以實驗目的為準繩。
⑤ 報告基因：例如β-半乳糖苷酶、EGFP、luciferase等，便於迅速檢查功能基因是否表達的陽性判斷，表達成功的蛋白在小鼠體內分布位置，直接看EGFP、luciferase的螢光就ok。
⑥ 引物結合區（primer）：一般位於多克隆位點區的上、下遊，便於通用引物的PCR驗證、測序驗證之用。
可能有些童鞋會問：為什麼質粒圖譜上有的箭頭順時針有的箭頭逆時針，那其實是代表DNA兩條鏈（正義鏈和反義鏈），即質粒是環狀雙鏈DNA，它的啟動子等在其中一條鏈上，而它的抗性基因在另一條鏈上。
五、質粒載體獲得的途徑
質粒載體可以無限擴增，所以大部分質粒都可以相互轉贈的，實驗室與實驗室之間，或者看到哪個paper裡有提到這個質粒，聯繫作者索取。如果實在找不到，就去生物論壇詢問，有的免費，有的出點小錢，或者聯繫一些小公司，一般問題不大。
但是，但是，但是，重要的事情說③遍，拿到質粒載體之後一定要去測序公司測個序，驗證該質粒的真偽或者是否有突變，再開始做實驗，否則錯的質粒做到最後才發現的感覺就好比：好不容易把孩子拉扯大了，卻發現不是親生的。
質粒的標準圖譜推薦到www.addgene.org上查詢。
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備註：入群學習
從以下20個熱點入手，每天給大家分享乾貨：
1
miRNA非經典機制
11
腸道菌群
2
lncRNA的10種機制
12
細胞自噬
3
circRNA
13
細胞焦亡、鐵死亡
4
ceRNA
14
間充質幹細胞
5
轉錄因子
15
腫瘤幹細胞
6
可變剪接
16
外泌體
7
SNP
17
氧化應激
8
泛素化修飾
18
調節性T細胞
9
組蛋白修飾
19
RNA甲基化修飾
10
蛋白激酶和磷酸酶
20
腫瘤微環境
而這些研究方向參與疾病發生發展過程的分子機制，可以歸納總結為一下幾類研究：
①分子（DNA、RNA、蛋白質、小分子）的表觀遺傳修飾；
②分子拷貝數的表達變化差異；
③RNA分子的剪接加工、出核、細胞組織水平的時空變化研究；
④特殊的一群細胞類型研究、細胞通訊微環境研究；
⑤具有臨床應用潛力的新技術（CRIPSR）或者載體（膜結構、細胞等）；
⑥關注細胞生理學現象：自噬、凋亡、線粒體失功等；
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