質粒一個構建需要多久

2021-02-20 universebiologygirl

Part 1：引物設計

引物設計前，我們需要了解質粒的序列和圖譜。以pLVX-Puro為例，我們最需要了解的有：酶切位點、標籤以及抗性。

1、酶切位點選擇啟動子後面的MCS區的酶切位點，需要確認的有（1）酶切位點在質粒上是單酶切.（2）在目的基因上不能有所選擇的酶切位點.（3）為了避免載體自連要確保兩個酶切位點產生的黏性末端不能互補。（4）兩個酶切位點不能離的太近，至少不小於5bp，隔得遠一點質粒酶切的時候效果更好。如圖質粒我選擇的就是實驗室最常用的Xhol和EcoR I兩個酶切位點。

2、根據需要選擇帶各類標籤的載體。如果載體上不帶蛋白標籤，並且你需要的標籤比較小（比如HA tag，只有十幾bp）可以直接通過引物把標籤連到載體上。

3、抗性，主要有氨苄抗性和卡那抗性，小心別用錯抗生素啦，不然當然啥也長不出來啦 

了解了這些之後，可以設計引物了，根據個人喜好選擇一款引物設計軟體，嗯，我用的是Vector NTI。設計引物時，在目的基因引物的5』端加上酶切位點，重頭戲來了！！！！你以為加上酶切位點就完事兒了嗎？

知道保護鹼基怎麼加要加幾個夠用不？不加保護鹼基後果很嚴重！做個比喻，如果你的目的基因是根筷子，那麼從中間掰肯定容易掰斷，但是你從一端掰就難的多，所以加保護鹼基的目的就是為了讓限制酶工作的時候「省力」。事實上，關於要加幾個保護鹼基才能省力，查查你限制酶官網的說明書就知道啦

其他的，引物長度一般在16bp-30bp，加長其實也沒事，最長的我試過50-60bp;GC%一般50%左右，最好不要超過40%-60%這個範圍，不然引物很可能結合不上去啦（其實我在迫不得已的情況試過70%GC，最後沒毛病，建議不要輕易嘗試，發生什麼不好的事兒別怪我，哦呵呵呵），另外正反引物GC差不超過10%；Tm值，50-70℃，正反引物Tm差也不超過10℃，如果Tm值比較高，建議可以使用退火溫度和延伸溫度一樣的PCR程序，具體的感興趣可以私聊~

相關焦點

  • 看懂質粒圖譜,學會同源重組構建質粒
    理想的運載體是質粒(plasmid)，在基因工程中，常用人工構建的質粒作為載體。載體構建即是構建含外源DNA的質粒。本文主要為大家介紹質粒圖譜的閱讀及通過同源重組構建質粒的方法：構建質粒，學習閱讀質粒圖譜是必不可少的一環，下圖為實驗室常用的一種質粒：（1）箭頭：大多數質粒都會有箭頭，箭頭有兩種解釋。
  • siRNA質粒載體構建
    siRNA質粒載體構建 來源：來源網絡 2007-08-03 21:41
  • 質粒構建:從入門到精通之高手進階
    ：從入門到精通之初窺門徑》、《質粒構建：從入門到精通之上下求索》（點擊標題閱讀）中給大家介紹了質粒構建的一些基本知識，在本期中將繼續為大家帶來質粒構建相關的乾貨，在本文中將為大家簡單介紹一下Kozak序列，並教大家如何在構建質粒之時添加Flag/HA等標籤、如何判斷該載體上的酶切位點是否有移碼以及如何添加鹼基避免移碼
  • 植物乳桿菌內源性質粒序列分析及其表達載體的構建
    多數乳酸桿菌攜帶有數個質粒，大小不一，其中多數質粒為隱蔽性質粒，少數質粒具有某些特殊功能。目前，已有許多乳桿菌質粒被測序，並用於構建質粒載體。國內開展的乳酸菌天然質粒的分離及功能分析的研究較少，導致利用基因工程手段對乳酸桿菌的改良受到嚴重限制。由於乳酸菌是食品級的益生菌，其攜帶的質粒也是食品級的，不存在食品安全問題。
  • 質粒載體構建服務
    基因編輯原理CRISPR/Cas9系統是一種原核生物的免疫系統，是細菌用來抵抗病毒和外源質粒入侵的一種防禦機制。雙gRNA載體雙gRNA載體，可應用於大片段敲除的方案中，設計dual-gRNA構建在一個載體上，轉染細胞，可大大提高細胞轉染效率。質量控制標準：提供載體酶切和測序驗證報告。
  • 閱讀質粒圖譜
    一、一個合格質粒的組成要素  複製起始位點Ori 即控制複製起始的位點。原核生物DNA分子中只有一個複製起始點。而真核生物DNA分子有多個複製起始位點。回答有人之前提出的一個問題：為什麼質粒圖譜上有的箭頭順時針有的箭頭逆時針，那其實是代表兩條DNA鏈，即質粒是環狀雙鏈DNA，它的啟動子等在其中一條鏈上，而它的抗性基因在另一條鏈上.三、介紹一下關於載體的知識（雖然課本上都有寫）1.
  • 合成生物學系列之多質粒共容
    生物學功能並不是由一個基因或一種蛋白來控制和完成的，它需要多個相關基因或蛋白的共同作用，需要將多個外源基因在同一細胞內共同表達。在生物合成途徑等多個領域中，多基因共表達具有重要的應用價值。大腸桿菌共表達系統目前實現多基因的表達依賴於大腸桿菌共表達系統，而現有的大腸桿菌共表達系統主要分為2類，一類是多順反子表達系統，另一類是多質粒表達系統。
  • 解決在質粒提取過程中遇到的10大基本困惑!
    首先，質粒的提取可分為質粒小提、質粒中提、質粒大提。目前大多數實驗室都選用試劑盒方法來提取質粒，可以根據不同的實驗需求，來選擇相應的試劑盒。質粒小提主要是對於1ml-5ml的大腸桿菌菌液中質粒DNA進行小量提取，獲得的質粒用來進行常規的載體構建實驗。
  • 你可能提過很多質粒 卻不一定知道這些
    經常提質粒嗎？熟練之後，提質粒乃至質粒構建都很簡單。但如果真問起一些質粒的細節，可能很多人回答不了。不信隨我看看。質粒基本組成要素複製起始位點Ori即控制複製起始的位點抗生素 抗性基因 ——如常見的Amp+、Kan+，可便於加以檢測或者篩選多克隆位點MCS——用於克隆攜帶外源基因片段P/E——啟動子/增強子Terms——終止信號poly（A）信號——可起到穩定mRNA作用如何閱讀質粒圖譜
  • 質粒是科研的傳承者和見證人,你認識他麼?
    和春卷一起看圖學質粒，試圖在一篇文章中，快速學習質粒結構。思來想去，學習總不能一蹴而就；另外，在見識到本學院博士生PAC和QE過程中評委提問的內容之細節，頓覺現在要開始準備了（評委們真的會請答辯者描述ZFN、TALEN和CRISPR的區別）。於是打算開啟一個質粒系列，希望藉此補充個人的背景知識，也同樣希望大家不吝賜教。1.
  • 質粒和染色體有什麼不同?答案很簡單!
    在分析染色體和質粒的基因序列之前，我們首先需要知道他們之間的區別。
  • 史上最全質粒圖譜及看法,值得收藏!
    pcDNA3.1(-)和pcDNA3.1(+)，構建表達載體常用思密達~強大的pEGFP質粒家族，構建具有綠色螢光的融合蛋白，麥子的摯愛~pDsRED1-C1: C代表在DsRed1的C段插入序列構建融合蛋白
  • 質粒發展史
    誠然，這種感覺就好比小師妹整天嚷嚷著「皮皮蝦，我們走」「皮皮蝦所不能承受之重」，鬥圖鬥得可溜了，結果昨晚真的請她去吃皮皮蝦了，第一次見到皮皮蝦的她被嚇得一個勁兒地往角落裡躲，知其然不知其所以然！但其實不然，有些基因信息還可以存在於染色體外，1952年Joshua Lederberg創造一個詞兒「質粒(Plasmid)」，指的是任何染色體外的遺傳決定物質，共價、閉合、環狀雙鏈DNA（cccDNA），大小從1kb~1000kb
  • 啥是質粒?從生物武器到轉基因食物都跟它有關
    在天然條件下，藉助細菌的接合作用，絕大多數野生型質粒可以從一個宿主細胞轉移至另一個宿主細胞，甚至還可以進入親緣關係較近的不同種宿主菌中。這一過程依賴於質粒轉移相關基因——mob基因的表達產物與其他蛋白因子的相互作用：mob基因編碼移動相關蛋白，在tra轉移蛋白的結合作用下，將質粒轉移到新宿主細胞的nic缺口位點，質粒即可通過缺口進入到新的新宿主細胞中[4]。
  • SnapGene使用方法-質粒和基因片段根據酶切位點連接
    SnapGene因其使用方便，尤其是製作的質粒圖譜美觀大氣，越來越多的受到分子生物學研究人員的喜愛。在此，跟大家分享在質粒圖譜中，利用酶切連接的方法插入基因片段的圖譜製作方法。在基因序列中加入需要的酶切位點，如加入NcoI 和BamHI位點。
  • 關於質粒的小知識
    廣義上說幾乎所有的細胞都有質粒（比如線粒體DNA），狹義上指存在於許多細菌、酵母菌、放線菌等生物中的質粒。質粒與染色體DNA一樣都是雙鏈DNA分子，質粒亦可攜帶遺傳信息，質粒上面一般含有幾個到幾百個基因，控制著細菌的抗藥性、固氮、抗生素生成等性狀。然而質粒也有一些與染色體DNA不同的特性。
  • 蛋白質設施:開放新冠病毒全部蛋白質表達質粒
    所有新冠病毒編碼的29種蛋白質的表達質粒的構建已經全部完成，由國家蛋白質科學研究（上海）設施蛋白質庫進行存儲和分發，6月17日起面向全球開放並提供服務，以實現蛋白質資源的快速共享，助力新冠肺炎病毒的防治研究。蛋白質庫一期以蛋白質表達質粒庫為主，提供蛋白質表達質粒的存儲和寄送服務。
  • AAV載體構建莫發愁,金唯智Hi-Fi技術為你解憂!
    為產生重組腺相關病毒(rAAV)，哺乳動物或昆蟲細胞通常需要共轉染兩個或者三個質粒——其中一個或兩個質粒提供AAV包裝複製元件和腺病毒輔助元件，另外一個質粒(AAV質粒)包含兩端帶有ITR序列的目的基因表達框。
  • 知識分享:質粒提取
    知識分享：質粒提取實驗原理現在較常用的質粒提取方法有三種:鹼裂解法、煮沸法和去汙劑裂解法，前兩種方法較為劇烈，適用於較小的質粒（＜15Kb），而去汙劑裂解法則比較溫合，一般用於分子量較大的質粒（＞15Kb）。
  • 質粒[plasmid] 的製備
    質粒[plasmid] 的製備 來源：來源網絡 2007-06-20 20:49 質粒是攜帶外源基因進入細菌中擴增或表達的主要載體，它在基因操作中具有重要作用。