質粒到底是什麼？病毒？生物武器？萬惡之源？在它身上到底有何奧秘與神奇之處？
撰文 | 賀文輝（陸軍軍醫大學基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室）
DNA儲存著世代相傳的遺傳信息，被譽為「生命的密碼」。從沃森和克裡克發現DNA雙螺旋結構的那一刻起，DNA的「魔幻之盒」被打開，越來越多不同類型的DNA分子被解密。研究發現，大多數DNA分子呈線性結構，例如人的染色體DNA，如果將單個體細胞中的DNA分子全部展開，長度可達2-3米。然而有一類存在於細菌中的DNA分子卻呈環狀，穿梭在浩瀚的DNA分子宇宙。雖然它的大小只有細菌染色體的千分之一，卻魔力無窮——它就是神奇的「質粒」（plasmid）。
左：細菌染色體DNA的線性結構；右：質粒的環狀結構
（By User: Spaully on English wikipedia - Own work， CC BY-SA 2.5，https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=2080850）
似病毒而非病毒
20世紀40年代，炭疽熱橫行美洲。這是一種人畜共患的急性傳染病，起初流行於美國德克薩斯州的鹿群，造成大批鹿群死亡。隨後在人群中發現了同樣的症狀：皮膚壞死、潰瘍、焦痂、毒血和組織廣泛水腫……最終，感染者因出現肺、腸和腦膜的急性感染而喪命[1]。
科學家們試圖通過尋找感染源來攻克這一傳染病。他們發現，真兇是炭疽桿菌中的一種毒性物質。並且，他們認為這種物質為病毒，通過快速繁殖而感染宿主細胞，引發動物或人生病。直到1950年，美國生物學家喬治·萊德伯格（Joshua Lederberg）才證實這種物質並非病毒，並於1952年將其命名為「質粒」。
質粒是一種大小在1-200kb不等的環狀DNA分子，獨立於細菌染色體之外，並且具有自我複製能力。細菌中的質粒含量最為豐富，螺旋體、放線菌和酵母等微生物中也有發現。電鏡下的質粒是共價、閉合、環狀、小型的雙鏈超螺旋DNA分子，形似「麻花」[2]。由於發現質粒和其在細菌基因重組中的功能，萊德伯格斬獲了1958年的諾貝爾生理學和醫學獎。那麼，質粒與病毒到底有何異同，為何能迷惑科學家如此之久？首先，質粒與病毒一樣，都能進行自我複製，快速繁殖；其次，它們都能賦予宿主一定的表型，引發性狀改變。但兩者的不同也很明確：病毒是由一個核酸分子（DNA或RNA）與蛋白質構成的非細胞形態，是寄生於生命體甚至非生命體的入侵有機物種。一般的病毒都有兩到三個組成成分：RNA或DNA，蛋白質，脂質（部分病毒沒有）。而質粒只有一種成分，即DNA，並且質粒還是細胞的組成部分。
雖然病毒和質粒並不相同，但存在千絲萬縷的聯繫。2017年，澳大利亞新南威爾斯大學的研究團隊在南極考察時，在古細菌體內發現了一種特殊的質粒，它的外表和行為都很像病毒，卻缺少表明其是病毒的基因。可以說，這是一種帶有病毒屬性的質粒。研究團隊據此推測，最早出現的病毒可能就是從這樣的質粒進化而來的[3]。
不安分的獨行俠
質粒DNA如同「黑客」一般，能夠擺脫宿主染色體DNA複製調控系統的束縛，獨立「編程」自主複製。這主要歸功於質粒DNA上的複製起始位點，可以開啟自身的複製，還有相應的調控基因，可以控制複製的頻率。這意味著質粒能夠改變宿主細菌的特性，從而發揮效力。
此外，質粒還具有可轉移性。在天然條件下，藉助細菌的接合作用，絕大多數野生型質粒可以從一個宿主細胞轉移至另一個宿主細胞，甚至還可以進入親緣關係較近的不同種宿主菌中。這一過程依賴於質粒轉移相關基因——mob基因的表達產物與其他蛋白因子的相互作用：mob基因編碼移動相關蛋白，在tra轉移蛋白的結合作用下，將質粒轉移到新宿主細胞的nic缺口位點，質粒即可通過缺口進入到新的新宿主細胞中[4]。然而，一山不容二虎，如果兩種質粒具有相同或相似的複製子結構及調控模式，它們就不能穩定地存在於同一宿主細胞內，這種現象稱為質粒的不相容性。
生物武器黑歷史
質粒的宿主細菌很多，有我們熟知的大腸桿菌、枯草桿菌，還有令人聞風喪膽的炭疽熱芽孢桿菌（炭疽桿菌）。依託這一菌種研製的生物武器——炭疽彈，是人類開始認識病原菌後研發的第一個生物武器。
1870年，科學家羅伯特·科赫（Robert Koch）分離出炭疽桿菌。他發現這種細菌生命力極強、易培養、穩定性高，體外保存六個月仍能保持足夠的毒性和感染性。然而，科赫當時並不知道炭疽桿菌致命的真正原因。直到19世紀末，科學家才發現炭疽桿菌毒力因子的來源是pXO1和pXO2兩個質粒。其中質粒pXO1含有編碼產毒基因，可以產生毒力因子和各種毒素，質粒pXO2含有編碼細菌莢膜蛋白合成所必須的基因。兩個毒性質粒彼此依存，任何一個質粒缺失都將降低炭疽桿菌的毒性，產生減毒株[5]。
炭疽桿菌電鏡觀察圖（來源：美國CDC - Janice Haney Carr）
第一次世界大戰期間，德國間諜部門將炭疽桿菌裝入可消化試管，包埋於飼料當中，以毒殺中立國的軍馬，拉開了現代細菌戰的帷幕。1928年，蘇聯生物武器之父雅科夫·費什曼（Jacov Fishman）發現炭疽桿菌有很高的強度和韌性，能承受爆炸衝擊和乾燥處理，因此可以裝入炸彈、炮彈和飛彈，實現武器化，未來可能成為對人類威脅最大的一種生物戰劑[6]。1939年，臭名昭著的日本731部隊在我國華中浙、贛地區大量培養炭疽桿菌，並用活人進行細菌試驗及細菌武器效能試驗，致使我國軍民大批死亡。其中HA型炸彈（哈彈）即為炭疽桿菌炸彈，外型酷似普通的鋼殼炸彈，而內含的榴霰彈一旦爆炸，炭疽桿菌就會通過傷口感染殺傷目標，同時造成可延續數十年的地面汙染。1942年，英國徵用了蘇格蘭的一個小島——格林亞德島進行炭疽桿菌試驗，計劃向德國牧場投放炭疽彈殺死大批牲畜，以切斷肉食供應（因此該計劃又稱「素食行動」），同時製造全國性的炭疽熱爆發，以除掉希特勒的納粹政權。二戰結束後，美國一直秘密進行炭疽戰劑的研發，如R-400型炸彈。然而，美國在2001年遭遇了前所未有的生物恐怖襲擊，被稱為「美國炭疽事件」。這一事件引起了全球範圍的軍事反思，各國陸續開始履行《禁止生物武器公約》，生物武器的研發目的從攻擊轉為防禦。炭疽桿菌的研究嚴格限於實驗室內進行，包括炭疽桿菌的基因改造以及疫苗的研發。目前，包括我國在內的很多國家已經研製出炭疽桿菌疫苗。
炭疽桿菌疫苗（來源：疫苗生產商Emergent BioSolutions）
亦魔也亦佛
當然，質粒並不是萬惡之源。20世紀70年代，科學家開始對天然野生型的質粒進行改造，並應用於基因工程技術，開啟了基因工程新的大門。在保留天然質粒優勢的基礎上，人工改造的質粒增加了抗性標記，人們可以根據需求篩選不同的菌株。同時，質粒上還可以設計多克隆位點，利用相關的酶將質粒分子打開，接入外源DNA，利用質粒自我獨立複製的特性，將外源DNA的信息傳遞給宿主細菌，從而實現性狀的改造。
構建重組質粒的步驟：1. 獲取含有質粒的菌株；2. 提取質粒並用相應的酶剪切質粒；3. 外源基因連接到剪切後的質粒，構建重組質粒；4. 重組質粒轉入新的菌株；5. 新的菌株獲得新的性狀。（來源：http://eschool.iaspaper.net/what-is-genetic-modification/the-process-of-genetic-engineering/）
根癌農桿菌致瘤質粒（tumor-inducing plasmid，簡稱Ti質粒）的發現具有劃時代意義，引導人類進入轉基因技術時代。Ti質粒是存在於根癌農桿菌細胞擬核區之外的能自主複製的雙鏈環狀DNA分子。1977年，比利時分子生物學家馬克·萬·蒙塔古（Marc Van Montagu）和約瑟夫·舍爾（Jozef Schell）證實，這種Ti質粒能將外源基因整合到宿主植物的基因組中，產生優良性狀，如抗病蟲害、抗鹽鹼、耐除草劑、延長果蔬貯存期等，利用這一過程還可生產藥物、抗體、疫苗等。
與Ti質粒相關的應用中，最引人注目的是轉基因食品。從理論上講，人類可以通過Ti質粒轉化手段，按照自己的意願改造植物，得到所需要的食品。事實上，自從1983年科學家將來自細菌的氯黴素抗性基因轉入菸草中，並獲得世界上第一例轉基因植物開始，人類就沒有停止轉基因食品的研製。越來越多的轉基因食品走出實驗室，走進人們的生活，如轉基因大豆、轉基因馬鈴薯等。
以轉基因馬鈴薯為例，科學家將含有抗旱相關基因的DNA片段通過PCR技術進行體外擴增，合成之後利用各類酶剪切DNA片段，再把產物拼接於Ti質粒多克隆位點處，得到重組質粒。重組後的質粒通過根癌農桿菌介導，侵染馬鈴薯愈傷組織，作物即可獲得外源抗旱基因，從而表現出耐旱性。
轉基因馬鈴薯培育步驟：1. 獲取Ti質粒；2. 獲取目的基因；3. 構建重組質粒；4. 根癌農桿菌介導轉化侵染薯塊；5. 形成愈傷組織；6. 愈傷組織發芽成苗；7. 試管苗結薯；8. 結成的小薯種入大田無性繁殖；9. 形成具有目的性狀的馬鈴薯。（作者製圖）
爭議與前景
從誕生的一刻起，圍繞轉基因食品的爭議就從未停息。雖然還沒有任何證據表明轉基因食品會對人體健康造成危害，但是對於基因操作過程中可能發生的意想不到的變化，以及其對於健康和環境的長期影響，目前科學研究還不夠深入。因此，很多國家和地區，如美國、英國、法國、澳大利亞、紐西蘭等，都制定了相應的法律法規，對轉基因食品進行標註和嚴格管控。
與此同時，隨著克隆技術的不斷發展，質粒的「魔力」也越發得以施展，人工構建的質粒DNA序列的克隆、擴增、表達及保存得到了廣泛的應用。2017年，世界上首對體細胞克隆猴「中中」「華華」誕生，標誌著我國在非人靈長類疾病動物模型研究中處於國際領先地位。這種依託質粒載體的無性克隆體系，加速了針對多種腦疾病（阿爾茨海默病、自閉症等）以及免疫缺陷、腫瘤、代謝性疾病的新藥研發進程。
體細胞克隆猴「中中」和「華華」日常生活狀態（來源：中科院腦科學與智能技術卓越創新中心）
質粒雖然是微生物細胞中的極為微小的組分，但是在生物學的發展中具有十分重要的作用和遠大的前景[7]。它像一把鑰匙，打開了基因的「魔盒」，既為人類帶來健康和福祉，又可能引發災禍與戰爭。在生物技術迅猛發展的今天，我們只有利用好這把雙刃劍，才能讓質粒繼續造福人類，推進社會的可持續發展。
參考文獻
[1] Dibyendu Banerjee, Baishali Chakraborty, Banya Chakraborty. Anthrax: Where Margins are Merging between Emerging Threats and Bioterrorism[J]. Indian Journal of Dermatology, 2017, 62(5):456-458.
[2] BIRNBOIM,H C. A rapid alkaline extraction method for the isolation of plasmid DNA[J]. Methods in Enzymology, 1983, 100.
[3] Erdmann S , Tschitschko B , Zhong L , et al. A plasmid from an Antarctic haloarchaeon uses specialized membrane vesicles to disseminate and infect plasmid-free cells[J]. Nature Microbiology, 2017, 2(10).
[4] María Pilar Garcillán-Barcia, María Victoria Francia, Cruz F D L . The diversity of conjugative relaxases and its application in plasmid classification [J]. FEMS Microbiology Reviews, 2009, 33(3):657-687.
[5] Genomic Characterization and Copy Number Variation ofBacillus anthracisPlasmids pXO1 and pXO2 in a Historical Collection of 412 Strains[J]. Msystems, 2018, 3(4).
[6] Sou-ichi, Makino.[Anthrax as a biological weapon].[J].Shokuhin eiseigaku zasshi. Journal of the Food Hygienic Society of Japan,2002,43(3):J228-32.
[7] Smalla K , Top E M , Jechalke S . Plasmid Detection, Characterization, and Ecology[J]. Microbiology Spectrum, 2015, 3(1)
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