來源：來源網絡 2006-12-14 21:44
第一節 概 述
在自然條件下,很多質粒都可通過細菌接合作用轉移到新的宿主內,但在人工構建的質粒載體中,一般缺乏此種轉移所必需的mob基因,因此不能自行完成從一個細胞到另一個細胞的接合轉移。如需將質粒載體轉移進受體細菌,需誘導受體細菌產生一種短暫的感受態以攝取外源DNA。
轉化(Transformation)是將外源DNA分子引入受體細胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段,它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領域的基本實驗技術。
轉化過程所用的受體細胞一般是限制修飾系統缺陷的變異株,即不含限制性內切酶和甲基化酶的突變體(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子進入體內並穩定地遺傳給後代。受體細胞經過一些特殊方法(如電擊法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化學試劑法)的處理後,細胞膜的通透性發生了暫時性的改變,成為能允許外源DNA分子進入的感受態細胞(Compenent cells)。進入受體細胞的DNA分子通過複製,表達實現遺傳信息的轉移,使受體細胞出現新的遺傳性狀。將經過轉化後的細胞在篩選培養基中培養,即可篩選出轉化子(Transformant,即帶有異源DNA分子的受體細胞)。目前常用的感受態細胞製備方法有CaCl2和RbCl(KCl)法,RbCl(KCl)法製備的感受態細胞轉化效率較高,但CaCl2 法簡便易行,且其轉化效率完全可以滿足一般實驗的要求,製備出的感受態細胞暫時不用時,可加入佔總體積15％的無菌甘油於-70℃保存(半年),因此CaCl2法為使用更廣泛。
為了提高轉化效率, 實驗中要考慮以下幾個重要因素：
細胞生長狀態和密度: 不要用經過多次轉接或儲於4℃的培養菌,最好從－70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉接用於製備感受態細胞的菌液。細胞生長密度以剛進入對數生長期時為好,可通過監測培養液的OD600 來控制。DH5α菌株的OD600 為0.5時,細胞密度在5×107 個/ml左右(不同的菌株情況有所不同),這時比較合適。密度過高或不足均會影響轉化效率。
質粒的質量和濃度: 用於轉化的質粒DNA應主要是超螺旋態DNA(cccDNA)。轉化效率與外源DNA的濃度在一定範圍內成正比,但當加入的外源DNA的量過多或體積過大時,轉化效率就會降低。1ng的cccDNA即可使50μl 的感受態細胞達到飽和。一般情況下,DNA溶液的體積不應超過感受態細胞體積的5％。
試劑的質量: 所用的試劑,如CaCl2 等均需是最高純度的(GR.或AR.),並用超純水配製,最好分裝保存於乾燥的冷暗處。
防止雜菌和雜DNA的汙染：整個操作過程均應在無菌條件下進行, 所用器皿, 如離心管, tip頭等最好是新的,並經高壓滅菌處理,所有的試劑都要滅菌,且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所汙染, 否則均會影響轉化效率或雜DNA的轉入, 為以後的篩選、鑑定帶來不必要的麻煩。
本實驗以E.coli DH5a菌株為受體細胞,並用CaCl2處理,使其處於感受態,然後與pBS質粒共保溫,實現轉化。由於pBS質粒帶有氨苄青黴素抗性基因(Ampr ),可通過Amp抗性來篩選轉化子。如受體細胞沒有轉入pBS,則在含Amp的培養基上不能生長。能在Amp培養基上生長的受體細胞（轉化子）肯定已導入了pBS。轉化子擴增後,可將轉化的質粒提取出,進行電泳、酶切等進一步鑑定。
第二節 材料、設備及試劑
一. 材料
E. coli DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS質粒DNA: 購買或實驗室自製,eppendorf管。
二. 設備
恆溫搖床,電熱恆溫培養箱,臺式高速離心機,無菌工作檯,低溫冰箱, 恆溫水浴鍋, 製冰機, 分光光度計,微量移液槍。
三. 試劑
LB固體和液體培養基：配方見第一章。
Amp母液：配方見第一章。
含Amp的LB固體培養基:將配好的LB固體培養基高壓滅菌後冷卻至60℃左右,加入Amp儲存液,使終濃度為50ug/ml,搖勻後鋪板。
麥康凱培養基(Maconkey Agar):取52g麥康凱瓊脂,加蒸餾水1000ml,微火煮沸至完全溶解,高壓滅菌,待冷至60℃左右加入Amp儲存液使終濃度為50ug/ml,然後搖勻後塗板。
0.05mol/L CaCl2溶液:稱取0.28g CaCl2(無水,分析純),溶於50ml重蒸水中,定容至100ml,高壓滅菌。
含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 稱取0.28g CaCl2(無水,分析純),溶於50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高壓滅菌。
第三節 操作步驟
一、 受體菌的培養
從LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α單菌落,接種於3-5ml LB液體培養基中,37℃下振蕩培養12小時左右,直至對數生長後期。將該菌懸液以1:100-1:50的比例接種於100ml LB液體培養基中,37℃振蕩培養2-3小時至OD600 ＝0.5左右。
二、 感受態細胞的製備 ( CaCl2 法)
將培養液轉入離心管中,冰上放置10分鐘,然後於4℃下3000g離心10分鐘。
棄去上清,用預冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml輕輕懸浮細胞,冰上放置15-30分鐘後,4℃下3000g離心10分鐘。
棄去上清,加入4ml預冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,輕輕懸浮細胞,冰上放置幾分鐘,即成感受態細胞懸液。
感受態細胞分裝成200μl的小份,貯存於-70℃可保存半年。
三、 轉化
從-70℃冰箱中取200μl感受態細胞懸液,室溫下使其解凍,解凍後立即置冰上。
加入pBS質粒DNA溶液(含量不超過50ng,體積不超過10μl),輕輕搖勻,冰上放置30分鐘後。
42℃水浴中熱擊90秒或37℃水浴5分鐘,熱擊後迅速置於冰上冷卻3-5分鐘。
向管中加入1ml LB液體培養基(不含Amp),混勻後37℃振蕩培養1小時,使細菌恢復正常生長狀態,並表達質粒編碼的抗生素抗性基因(Ampr )。
將上述菌液搖勻後取100μl 塗布於含Amp的篩選平板上,正面向上放置半小時,待菌液完全被培養基吸收後倒置培養皿,37℃培養16-24小時。
同時做兩個對照:
對照組1: 以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,其它操作與上面相同。此組正常情況下在含抗生素的LB平板上應沒有菌落出現。
對照組2: 以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,但塗板時只取5μl 菌液塗布於不含抗生素的LB平板上,此組正常情況下應產生大量菌落。
四、 計算轉化率
統計每個培養皿中的菌落數。
轉化後在含抗生素的平板上長出的菌落即為轉化子,根據此皿中的菌落數可計算出轉化子總數和轉化頻率,公式如下：
轉化子總數＝菌落數×稀釋倍數×轉化反應原液總體積／塗板菌液體積
轉化頻率（轉化子數／每mg質粒DNA）＝轉化子總數／質粒DNA加入量(mg)
感受態細胞總數＝對照組２菌落數×稀釋倍數×菌液總體積／塗板菌液體積
感受態細胞轉化效率＝轉化子總數／感受態細胞總數
[注意] 本實驗方法也適用於其它E.coli受體菌株的不同的質粒DNA的轉化。但它們的轉化效率並不一定一樣。有的轉化效率高,需將轉化液進行多梯度稀釋塗板才能得到單菌落平板,而有的轉化效率低,塗板時必須將菌液濃縮(如離心),才能較準確的計算轉化率。
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