來源：ChemicalBook
背景[1-6]
Y190感受態細胞是GAL4系統酵母雙雜實驗用菌株，MATa型，可直接轉化質粒或與MATα型酵母菌株Y187通過mating操作進行蛋白互作驗證或篩庫試驗。Transformation marker為： trp1，leu2，cyh2；報告基因為： lacZ，HIS3，MEL1。Y190-GAL4酵母雙雜系統需要兩種質粒配套使用：(pGB和pACT2)或（pGBKT7和pGADT7）。
質粒pGB由pGBKT7改造而來，篩選標誌為TRP1，用於表達DNA-BD(來自酵母轉錄因子GAL4N端1~ 174位胺基酸)與目標蛋白(Bait)的融合蛋白；質粒pACT2與pGADT7的結構和功能類似，篩選標誌為LEU，用於表達AD(GAL4 C端768~881位胺基酸)與目標蛋白 (Prey)的融合蛋白。
GAL4系統原理：一個完整的酵母轉錄因子GAL4可分為功能上相互獨立的兩個結構域：位於N端1~174位胺基酸區段的DNA結合域 (DNA-BD)和位於C端768~881位胺基酸區段的轉錄激活域(AD)。DNA-BD能夠識別GAL4-responsive gene的上遊激活序列UAS，並與之結合。而AD可以啟動UAS下遊的基因進行轉錄。BD和AD單獨存在不能激活轉錄，但當二者接近時，則呈現完整的GAL4活性，使含有UAS的啟動子下遊基因轉錄表達。
正常條件下，BD不與AD結合，將要檢測的蛋白質分別與BD和AD融合，形成 bait融合蛋白(bait –BD)和 prey融合蛋白 (prey-AD)，如果 bait和 prey發生相互作用，就會促使 BD和 AD的相互接近，形成完整的GAL4，從而激活報告基因的轉錄。Y190感受態細胞經特殊工藝製作，-80℃可保存三個月，pGADT7質粒檢測轉化效率>104 cfu/μg DNA。
Y190感受態細胞操作方法：
1. Carrier DNA 在每次使用前要通過加熱處理使其變性為單鏈狀態，步驟如下：Carrier DNA 放95℃水浴或金屬浴3 min，快速插入冰中，靜置3 min，再次放95℃水浴或金屬浴3 min，快速插入冰中，靜置3 min以上。
2. 取100 μl冰上融化的Y190感受態細胞，依次加入預冷的目的質粒0.5-3 μg，Carrier DNA10 μl，PEG/LiAc 500 μl並吸打幾次混勻，30℃水浴30 min (15 min時翻轉6-8次混勻)。
3. 將管放42℃水浴15 min (7.5 min時翻轉6-8次混勻)。
4. 5000 rpm離心 40 s棄上清，ddH2O 400 μl 重懸，離心 30s棄上清。
5. ddH2O 50 μl重懸，塗板，29℃培養48-96 h。
應用[7][8]
Y190感受態細胞可用於酵母Coronin蛋白與Septin家族成員相互作用研究：
細胞周期(cell cycle)是細胞生命活動的基本過程，其精準調控對生物的生存、繁殖、發育和遺傳均具有極其重要的作用。Septin是一個從酵母到人都很保守的基因家族，釀酒酵母中Septin主要組成包括：Cdc3p、Cdc10p、Cdc11p、Cdc12p和Shs1p/Sep7p,Septin結構的變化與細胞周期密切相關。肌動蛋白骨架(actin cytoskeleton)是存在於細胞中複雜的蛋白質纖維網狀結構，參與細胞形狀的維持、細胞周期、信號轉導、增殖分化以及基因表達調控等幾乎所有的細胞生理過程。Coronin蛋白(Crn1p)是一種存在於真核生物中的、高度保守的與肌動蛋白骨架調控相關的蛋白質，在肌動蛋白細胞骨架的聚合和解聚過程中都發揮了重要的作用。但目前關於肌動蛋白骨架如何參與細胞周期的調控研究甚少。
本研究以釀酒酵母為研究材料，對釀酒酵母中Coronin蛋白與Cdc3p、Cdc10p、Cdc11p、Cdc12p和Shs1p/Sep7p之間的相互作用進行了初步探討，並對後續工作提出了設想。主要研究結果如下：
(1)通過酵母雙雜交實驗篩選出Cdc11p與Crn1p之間具有相互作用。以釀酒酵母S288c基因組DNA為模板，擴增出基因CDC10、CDC11和CDC12的全長序列，大小分別為969 bp,1248 bp和1224 bp,構建酵母雙雜交重組質粒p GBKT7-CDC10、p GBKT7-CDC11和p GBKT7-CDC12。p GADT7-CRN1分別同以上三個重組質粒分步轉化酵母菌株Y190,並通過對β-半乳糖苷酶活性的檢測篩選出Cdc11p與Crn1p具有相互作用。
(2)通過Pull-down實驗證實Crn1p與Cdc11p具有相互作用。以p MD19-T-CDC11為模板，擴增出基因CDC11全長序列，構建原核表達重組質粒p ET28a-CDC11。重組質粒p ET28a-CDC11和p GEX-4T-3-CRN1分別轉化E.coli BL21(DE3)進行異源表達，得到Cdc11蛋白和Crn1蛋白。最終通過Pull-down實驗證實Crn1p與Cdc11p之間的相互作用。
(3)通過免疫共沉澱實驗探索Crn1p與Cdc11p之間的相互作用。用限制性內切酶Sac I和Not I酶切重組質粒p ET28a-CDC11和質粒p YES3/CT,構建釀酒酵母表達重組質粒p YES3/CT-CDC11,並轉化釀酒酵母菌株BJ5457。同時在CRN1基因的C端融合Myc標籤，構建BJ5457 CRN1-Myc且含有p YES3/CT-CDC11的過表達載體的酵母菌株。
通過對其進行誘導前和誘導後形態觀察，發現當過表達Cdc11蛋白時，細胞表型異常，細胞子芽延長，且大部分細胞死亡。Co-IP檢測時未得到目的條帶，且總蛋白條帶也較少，猜測由於細胞表型異常導致。因此，本論文初步證實肌動蛋白骨架調控蛋白Coronin與細胞周期調控家族蛋白Septin家族成員Cdc11蛋白具有相互作用，結合前期研究結果：Asr1p蛋白與Coronin蛋白之間具有相互作用，且Asr1p影響細胞周期，我們初步得出一條完整的肌動蛋白骨架調控細胞周期的信號通路。
參考文獻
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[3]New insights into the phylogenetic distribution and evolutionary origins of the septins[J] . Ryuichi Nishihama,Masayuki Onishi,John R. Pringle. Biological Chemistry . 2011 (8-9)
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[8]李國濤. 酵母Coronin蛋白與Septin家族成員相互作用研究[D].雲南師範大學，2017.