基因克隆:高效感受態細胞製作

2020-11-22 生物谷
方法一

A液：1M，MnCl2：
B液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用無菌水配，配後不需滅菌；
C液 稱取CaCl2 0.10g，KCl 1.18g，全部轉入細口試劑瓶，然後加入46ml三蒸水，輕輕振蕩使所有組分充分溶解。將瓶塞蓋上並用牛皮紙、棉線包紮，然後放入滅菌鍋121℃高壓滅菌備用。
取1管B液（0.6ml），全部加入C液(46ml)中，混勻後，再用1ml移液器加入3.3ml A液，混勻冰浴即可使用。
劃線得到單菌落,37℃培養箱培養約17小時， 挑取2-4個形態飽滿的單菌落接種於裝有100ml SOB 培養基的三角瓶,37℃劇烈振蕩（300 rpms）培養3-4小時, 將培養溫度調至18℃劇烈振蕩（3280 rpms）培養，其餘與普通感受態差不多，每管加入4ml TB緩衝液，輕輕振蕩，使菌體重新懸浮，加入280ml DMSO（可用國產分析純），混勻後分裝入1.5ml EP管，冰上靜置15分鐘。用紗布將所有裝有感受態的EP管包好，用棉線系好後放入液氮中速凍，在液氮中靜置12小時以上。取出感受態放入-70℃超低溫冰箱備用。
效率非常高，一般可到10*8，好時可到10*9，特別適宜於大片段與文庫構建及珍貴材料的連接轉化。

潔淨是最重要的。無菌都無所謂，在操作臺上可正常操作。離心力要注意不要超過2500g,建議1500-2000g 5min。塗板要注意，不要覺得不勻而多次反覆，輕輕在平板上帶一下感覺板上大部分地方走過即可，特別在冰箱中保存過或在溫箱中溫浴2小時以上的板。塗完後建議空氣晾乾（20-30分鐘）這樣會減少衛星菌落出現。

預冷是必要的。整個過程的低溫也並非特別重要，只要注意就行了，我在去殘液時經常在室溫倒置1min，對感受態效率提高有幫助，第一次多加一點緩衝液，我經常加至20ml，效果不錯。

關於大腸桿菌的感受態製備及轉化的方法很多，最複雜的莫過於電轉化，而最簡單的則是將LB平板上的菌落直接挑入裝有緩衝液的EP管冰箱即開始轉化。對於做克隆工作的人而言，高而穩定的感受態可減輕不少麻煩。
現在大腸桿菌轉化效率最高的要數電轉化，可達到1010，但是操作起來比較麻煩。要想又簡單，又能有較高的轉化效率，最好的莫過於1990年《gene》上刊登的由Inoue H.等提出的高效感受態的製備與轉化方法。
根據實驗室的實際情況，我們將其稍作修改，做成了GLP文件，但其中仍有許多可改進或需要注意的地方，其中有一些對普通感受態效率的提高也有一定的幫助。

 

 


1、所用器具的潔淨程度。這一點非常重要，是所有與感受態有關的方法與文章上必講的，毋庸置疑。
2、培養基的裝量：培養基的裝量是很重要的，這關係到菌體生長過程中的能量代謝問題，是有氧還是無氧生長。厭氧生長出來的菌體是做不出效率高的感受態的。建議裝量不要高於此值為：培養基體積/三角瓶容量=100ml/500ml，50ml/250ml。
3、培養基的pH值。這是講的pH值並非單指配置或滅菌後的pH值，而且還包括整個搖瓶結束後的pH值。一般來說，接種前的pH值在6.8-7.2，等菌搖好後，可以測一下pH值，不要低於6.0，最好在6.5以上。這表示菌體的代謝為有氧代謝，生長狀態良好，按要求做，肯定效率不低。
4、培養後的OD值。其實這並一個非常重要的參數，只是當OD值大到一定的程度後，菌體要保持對數生長已經不太可能，因此很多指導方法上強調OD不得大於0.6，0.8等等。同時，OD值大時菌體總量大，因而感受態絕對數量要大一點，因而需要在OD值的兩方面影響中找一個平衡點。
5、培養基中的各種離子。經驗證明，當培養基中存在一定量的Mg2 離子時，該方法製得的感受態要相對較高。在製備普通感受時，使用20mM MgCl2做為培養基的添加物，在感受態收穫之前20-30分鐘加入，會收到很好的效果。
6、培養溫度。文獻及經驗告訴我們，較低的溫度培養有利於感受態的形成，這樣可以獲得較高的感受態，但太低又不實用，因而產生了Inoue的高效感受態製備方法，它實際是利用了所有有利於感受態的文獻而得出的一個非常理想方法。
7、此外文獻報導，在保存感受態時，DMSO要比甘油的效果要好，它會使感受態的效率增加。
8、液氮速凍也會使感受態的效率提高，因此推薦用液氮速凍感受態，然後保存於超低溫冰箱內。至於在液氮中保存12小時以後再轉入超低溫冰箱，這點未做實驗，只是一種感覺，第一次這樣做了，沒問題，以後就照此辦理而已。

方法二

1.液氮或低溫冰箱中取出的大腸桿菌*E.COLI DH5, JM109,HB101等,在LB平板上劃線,37度過夜至長出單菌落.
2.挑直徑1-3毫米的單菌落*可多個, 接種到250毫升/3升錐形瓶 或80毫升/1升錐形瓶的SOB培養基. 培養基量不可再多,會影響效率.
3.在18度 150-250RPM 培養19-50小時*沒有冷卻搖床的可在室溫, 但不可高於37度.
4.OD600約0.4-0.8時停止培養, 放在冰水中冷卻10分鐘
5. 4度, 300RPM離心15分鐘, 回收菌體
6.去掉上清後, 用1/3體積的冰冷TB溶液懸浮, 在冷10分鐘
7.再次離心回收菌體
8.用1/12.5體積的TB懸浮, 添加最終濃度為7%的DMSO, 再冷卻10分鐘
9.0.1-1毫升分裝, 直接在液氮中凍上.
10.在液氮或-80度保存.

 

 

【zihudie】
（1）將置於液氮保存的大腸桿菌劃線在LB平板上，37℃培養活化。
（2）挑取經活化的大腸桿菌單菌落於SOC液體培養基，18℃，200-250rpm培養。
（3）當OD600=0.5-0.8時，用預冷的40mL離心管於4℃，8000rpm離心10min，收集菌體。
（4）用預冷的TB Buffer重懸菌體，4℃，8000rpm離心10min，收集菌體。
（5）重複第4步操作。
（6）用8mL預冷的TB Buffer重懸菌體，緩慢加入DMSO至終濃度7% 。
（7）冰浴10min後，分裝保存於液氮中。
本法效率極高,建議大家採納

【yog】

1. 單菌落-------2ml LB 37度 120RPM過夜------1%轉接-------37度 200RPM2小時(OD到0.4~0.5)
2. 2ml, 冰浴15min, 4度, 6000RPM 5min, 棄上清, 懸浮於1ml0.1MCaCl2中, 冰浴20min
3. 4度, 6000RPM 10min, 重懸浮於200ul 0.1MCaCl2中, 冰浴30min

建議用TSS法，簡單方便，比氯化鈣法的轉化效率高.別的菌可能不一定適用。
以下為轉貼，具體方法請最好查閱文獻。

E.coli感受態細胞製備方法:
單菌落平板至2ml LB, 37℃ 250 r/m, 1ml 轉至50 ml LB, 37oC 250 r/m至 A600
=0.2-0.4
離心後用10毫升TSS重懸後,分裝 -70oC保存。儘量冰上操作.
轉化: 加質粒(<5 ul/100ul cell) 後冰上30分鐘，42℃ 90秒，冰上2分鐘，加LB至1ml
, 37℃ 1小時後鋪抗生素平板。
TSS:
7.0ml pH6.1 LB
2.0ml 50% PEG6000
0.5ML dmso
0.2ML Mg2 (0.1ml 1mol/l MgCl2 and 0.1ml 1mol/l MgSO4)
0.3ml ddH2O

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