黃麴黴毒素M1（aflatoxinM1，AFM1）屬於黃麴黴毒素類化合物，基本結構為一個羥基取代基的二呋喃環與一個氧雜萘鄰酮。奶牛食用黃麴黴毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）汙染飼料後，肝臟中的P450細胞色素酶將AFB1代謝成AFM1並分泌到牛奶中。人們飲用這種牛奶後，會對健康構成巨大威脅，乳製品的AFM1汙染在全球多地已有報導，解決乳製品中AFM1汙染的問題刻不容緩。
河北農業大學食品科技學院的霍 超、盧海強、桑亞新*等人對B. pumilus E-1-1-1來源的cotA基因克隆表達，並對重組酶的酶學性質進行表徵，進一步探究了 CotA漆酶在AFM1降解中的潛力，這為生物法降解AFM1提供了新的理論支持。
使用cotA-PF、cotA-PR為引物，以B. pumilus E-1-1-1的基因組DNA為模板進行PCR擴增，得到的特異性條帶與pEASY-T1載體連接構建pEASY-T1-cotA質粒，質粒轉入Trans1-T1感受態細胞後對陽性克隆子進行測序。分析測序結果得到B. pumilus E-1-1-1來源的cotA基因長度為1486 bp，編碼495 個胺基酸，不含信號肽，相對分子質量約58 kDa，理論等電點為5.94。
對質粒pEASY-T1-cotA和pET-30a（＋）進行雙酶切，使用T4 DNA連接酶連接雙酶切產物，熱激轉化E. coli（DE3），構建重組質粒pET-30a-cotA，陽性克隆經測序後，結果正確。用構建好的pET-30a-cotA重組表達載體，在E. coli（DE3）中採用低溫誘導法進行表達活力達到367 U/L。
動力學曲線回歸方程為y =3.794x＋1.2576，R2＝0.9935，該曲線擬合良好，可以作為反應動力學參數計算的方程模型。由回歸方程可計算得：Km為3.01 mmol/L，Vmax為0.795 mmol/（L·min）。
將人工汙染牛奶與CotA漆酶37 ℃貯存72 h後，AFM1的降解率為54.3%。以72 h作為降解AFM1的終點，是由於在已報導的生物降解黃麴黴毒素研究中降解終點的時間設置上有很大不同，但細菌降解時間3 d（28～37 ℃），真菌降解時間7 d（25～30 ℃）為較普遍條件。
使用CotA漆酶處理24 h後細胞存活率由AFM1對照組的81.5%上升到87.0%，72 h後上升到93.6%。AFM1細胞毒性的主導機制是DNA氧化損傷，其相互作用取決於細胞接觸的AFM1濃度，在較高質量濃度下，AFM1由於其親脂結構很容易被結合到細胞膜上，並以協同的方式發揮其細胞毒性。在CotA漆酶作用下AFM1對肝癌細胞的毒性減小說明AFM1濃度降低，同時證明CotA漆酶能夠有效脫除AFM1 。
對黃麴毒素解毒cotA基因進行異源表達，繼而獲得高活性的黃麴毒素降解酶，是生物法降解黃麴黴毒素的重要研究方向。本研究從B. pumilus E-1-1-1中克隆得到總長為1486 bp的cotA漆酶基因，並使用大腸桿菌成功表達，純化獲得的CotA漆酶蛋白最適溫度為40 ℃，最適pH值為4，60 ℃半衰期為6 h，pH 9條件下半衰期為8 h，對有機溶劑和NaCl具有相當大的耐受性。CotA漆酶對牛奶中的AFM1有很強的降解效果，降解率達54.3%，降解產物毒性顯著降低。實驗結果證明生物酶CotA可以有效降解AFM1並且不會產生其他有毒物質。目前，CotA漆酶還需要繼續進行基因優化，進一步提升該酶的應用潛力。
本文《短小芽孢桿菌漆酶基因的克隆表達及重組漆酶降解黃麴黴毒素M1研究》來自於《食品科學》2019年40卷10期92-98頁，作者：霍 超、盧海強、劉曉宇、李 琪、高 潔、桑亞新。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20180516-249。點擊下方閱讀原文即可查看文章相關信息。