感受態細菌的製備(化學法)

2020-12-01 中國教育裝備採購網

　　【基本原理】

　　重組DNA 分子需導入合適的宿主細胞(真核或原核細胞)才能進行複製，增殖和表達。用於分子克隆技術中的受體細胞為大腸桿菌K-12 的衍生菌(DH5α等)。細菌處於易於吸收外源DNA的狀態叫感受態。用理化方法可誘導細菌進入感受態。本實驗使用化學法(CaCl2)處理處於生長對數期的DH5α細胞，使其對外源DNA的通透性增加，以達到外源DNA 分子導入細菌中的目的。

　　【器材】

　　1.高壓滅菌鍋

　　2.培養皿

　　3.恆溫培養搖床

　　4.離心機

　　【試劑】

　　⒈ 細菌：DH5α

　　2.30 mmol/L CaCl2(滅菌)

　　3.LB培養基：配製每升培養基，應在950 ml去離子水中加入：胰蛋白腖10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g

　　搖動容器直至溶解，用5mol/L NaOH (約0.2ml )調節pH值至7.0，加入去離子水至總體積為1L，高壓滅菌20min 。

　　4.LB 瓊脂培養基：先按上述配方配製液體培養基，臨高壓滅菌前加入瓊脂 16～18 g。

　　【操作步驟】

　　1.將DH5α菌種在瓊脂培養平板上畫線，37℃培養12-16h。

　　2.從平板上挑取1個單菌落，移入含2ml LB的試管中，在37℃條件下，以220rpm的速度振蕩培養12-16h。

　　3.將2ml LB培養物轉移到含50 ml LB培養基的三角瓶中，37℃培養2-3h，使其OD600值在0.3-0.6之間 (即細胞處於對數生長期)。

　　4.將培養物於冰上放置10min , 離心(3000-4000rpm, 4℃) 10min, 收集細菌。

　　5.棄上清, 在沉澱中加入10ml 預冷的30mmol/L CaCl2 懸浮細菌, 在冰上放置40-60min 。

　　6.離心(3000-4000rpm, 4℃) 10min , 回收細菌。

　　7.棄上清, 將細菌重新懸浮於2 ml 預冷的30mmol/L CaCl2溶液中。

　　8.感受態細菌於48h內使用, 或將已製備好的感受態細菌分裝凍存(-70℃)。

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