NMY51感受態細胞採用NMY51酵母菌株，可直接轉化質粒進行蛋白互作驗證或篩庫試驗；此菌株Transformation marker為：trp1，leu2-3，報告基因為：HIS3，ADE2和lacZ，第一步通過營養缺陷型報告基因(HIS3，ADE2)進行選擇性生長篩選，進一步通過LacZ報告基因進行β-半乳糖分析顯色的定量或半定量篩選，三個獨立的報告基因，受不同啟動子的調控，降低假陽性機率。
原理：泛素(ubiquitin)分子量很小，由76 aa殘基組成；泛素作為降解信號分子，可以連接另外一種蛋白質的N端，然後被泛素專一性蛋白酶(UBPs)識別，從而導致與泛素相連的蛋白被酶解。泛素可以人為分成兩部分：N端(Nub)，C端(Cub)。
首先，人為地將泛素Nub的3位異亮氨酸突變為甘氨酸(NubI突變為NubG)。這樣與Cub的親合力大大降低，避免了Cub和Nub自我結合或接近的可能性。其次，將Cub部分與人工合成的LexA-VP16轉錄激活因子融合成一個融合蛋白Cub-LexA-VP16。正常條件下NubG不與Cub結合，UBPs也不能識別分離的泛素，轉錄激活因子也不會被切下來。最後，將要檢測的蛋白質分別與NubG和Cub融合，形成bait融合蛋(bait-cub-LexA-VP16)和prey融合蛋白(prey-NubG)。
如果bait和prey發生相互作用，就會促使NubG和Cub的相互接近，被UBPs識別，導致LexA-VP16的解離，進入核內，從而激活報告基因的轉錄。此系統可使用四種Bait質粒：pBT3-N，pBT3-SUC，pBT3-STE，pBT3-C，篩選標誌均為LEU；三種Prey質粒：pPR3-C，pPR3-SUC，pPR3-STE，篩選標誌均為TRP。
操作方法：
1.取100μl冰上融化的NMY51感受態細胞，依次加入預冷的目的質粒2-5μg，Carrier DNA(95-100度5min,快速冰浴，重複一次）10μl，PEG/LiAc 500μl並吸打幾次混勻，30度水浴30 min(15 min時翻轉6-8次混勻)。
2.將管放42℃水浴15 min(7.5 min時翻轉6-8次混勻)。
3.5000 rpm離心40s棄上清，ddH2O 400μl重懸，離心30s棄上清。
4.ddH2O 50μl重懸，塗板，29℃培養48-96 h。
注意事項：
1.感受態細胞最好在冰上融化。
2.轉化高濃度的質粒可相應減少最終用於塗板的菌量。
3.同時轉化2-3種質粒時可增加質粒的用量。
4.NMY51酵母菌株對高溫敏感，最適生長溫度為27-30℃；高於31℃，生長速度和轉化效率呈指數下降。
5.菌落變粉不是汙染，是酵母細胞生長中一個常見現象。當細胞在平板培養幾天後，平板上的Adenine被酵母消耗完畢，酵母試圖通過自身代謝途徑合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破壞，Adenine合成途徑受阻；又由於其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中間產物P-ribosylamino imidazole(AIR)在細胞中積累而使菌落變為粉紅色。
6.酵母在缺陷培養基中生長速度比YPDA培養基慢，培養基中缺陷成分越多，生長越慢，以轉化塗板為例：塗YPDA平板29℃，48 h培養可見直徑1 mm克隆；塗SD單缺平板29℃，48-60 h培養可見直徑1 mm克隆，塗SD雙缺平板29℃，60-80 h培養可見直徑1 mm克隆，塗SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90 h培養可見直徑1 mm克隆。
應用[7][8]
NMY51感受態細胞可用於腦心肌炎病毒衣殼蛋白與HuvEc相互作用蛋白的初步篩選：
腦心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)是一種單股正鏈無囊膜的RNA病毒,病毒的衣殼是由VP1、VP2、VP3及VP4四種結構蛋白組成,主要的抗原結構域位於VP1、VP2及VP3上,其中抗原性最強的為VP1。目前全世界EMCV流行的區域越來越廣泛,且感染率呈逐年增長的趨勢,但其侵染宿主的分子機制尚不明確。
本試驗旨在通過酵母雙雜交技術,篩選人臍靜脈內皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HuvEc)中與EMCV衣殼蛋白有相互作用的蛋白,並分析篩選到的目的蛋白在細胞中的定位、分子功能以及主要參與的生物學過程。本試驗應用分裂-泛素酵母雙雜交系統,構建EMCV衣殼蛋白VP1,VP2,VP3誘餌質粒,進行HuvEc細胞的cDNA文庫篩選。通過6次酵母雙雜交篩選試驗,β-半乳糖苷酶分析去除陰性克隆,酵母回返實驗去除假陽性克隆,初步篩選得到了57個有相互作用的蛋白。其中,與VP1互作的蛋白15個,與VP2互作的蛋白39個,VP3互作的蛋白3個。
BNIP3、C14orf1、SERP1、UBC、YIPF6與Bait VP1和VP2均互作;UBB與VP1,VP3均互作;SPCS1、ZUFSP與BaitVP1、VP2和VP3均互作。利用UniProtKB、PANTHER等生物信息學分析軟體分析獲知,篩選得到的互作蛋白主要分布在細胞質、細胞膜、細胞核、線粒體、高爾基體、內質網等一些細胞器中。這些蛋白的分子功能主要有催化活性、蛋白結合活性、分子結構活性、轉運活性、翻譯調節活性、通道調節活性等。主要參與的生物學過程有生物調節、細胞形成、細胞代謝、細胞增殖、細胞定位、轉運及免疫反應等許多個過程。
參考文獻
[1]Development of rapeseed with high erucic acid content by asymmetric somatic hybridization between Brassica napus and Crambe abyssinica.Wang YP,Sonntag K,Rudloff E.Theoretical and Applied Genetics.2003
[2]The method of cell fusion with the electric pulse.Zimmermann U.Biochimica et Biophysica Acta.1982
[3]Permeability changes induced by electric impulses in vesicular membranes.Neumann E,Rosenheck K.Journal of Membrane Biology.1972
[4]Electroporation in cells and tissues:A biophysical phenomenon due to electromagnetic fields.Weaver J C.Radio Science.1995
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[6]Medical Applications of Electroporation.Dev S B,Rabussary D P,Georg Widera,et al.IEEE Transactions on Plasma Science.2000
[7]Intergeneric hybridization of trichoderma reesei QM9414 and saccharomyces cerevisiae NCIM 3288 by protoplast fusion.Kumari J Anjani,Panda T.Enzyme and Microbial Technology.1994
[8]馬玉梅.腦心肌炎病毒衣殼蛋白與HuvEc相互作用蛋白的初步篩選[D].西北民族大學,2017.