在面對克隆項目時,科學家不再局限於傳統的限制酶克隆。相反,他們可以選擇一種分子克隆技術,該技術可以很好地滿足既定的資源,時間和實驗的需求。自從20世紀90年代末發明以來,Gateway克隆技術已作為一種非常流行的將DNA序列轉移到多個載體系統中快速且高效的方式。使用適當的入門和目的載體,科學家可以用Gateway將感興趣的基因克隆到各種表達系統中。
Gateway技術介紹
Gateway克隆方法由Invitrogen開發,它是λ噬菌體感染細菌時發生的整合和切除重組反應的一種體外形式。在體內,噬菌體(attP)和細菌(attB)的附著位點發生重組促進了這些重組反應。由於attP和attB位點之間的重組,噬菌體整合到細菌基因組中,兩側為兩個新的重組位點(attL-left-和attR-right-,圖1)。在某些條件下,attL和attR位點可以重組,導致噬菌體從細菌染色體上切除並重新生成attP和attB位點。
圖1:噬菌體整合和切除反應。attP和attB位點的重新組合生成了attL和attR位點。
Gateway載體包含修飾後的att位點,以便科學家可以輕鬆克隆其所需的DNA序列。Gateway技術依賴於下面描述的兩個反應:
(1)BP反應發生在插入物側面的attB位點和供體載體的attP位點之間。該反應由BP克隆酶混合物催化,並產生含有側翼為attL位點的目的DNA的入門載體。作為反應的副產物,ccdB基因從供體載體上切除。
圖2:Gateway系統將噬菌體整合到BP和LR反應中。BP反應創建了一個attL-flanked入口克隆。LR反應產生了一個表達克隆,包含了基因表達所必需的所有成分。
(2)LR反應發生在入門載體的attL位點和目標載體的attR位點之間。該反應由LR 克隆酶混合物催化。結果,產生了兩側具有attB位點的目的DNA的表達載體。而在BP反應中,從目的載體中切下含有ccdB基因的DNA片段。
一旦進行BP和/或LR反應,下一步是轉化至感受態大腸桿菌細胞中並挑選陽性克隆。插入載體和目的載體攜帶不同的抗生素抗性基因(此處用質粒顏色表示),使您可以輕鬆選擇表達載體。您還需要使用對ccdB敏感的大腸桿菌菌株(例如DH5α,TOP10,Mach1)。 ccdB基因在重組之前存在於供體載體和目的載體中,它在BP或LR反應期間與目的基因發生交換。由於ccdB蛋白抑制ccdB敏感的大腸桿菌菌株的生長,因此大多數菌落應含有所需的重組構建體。
如何用Gateway技術克隆
為了更好地理解這個過程,我們將通過一個示例實驗,使用Gateway克隆來生成我們想要的構建體:用慢病毒系統表達人類哺乳動物細胞中的KRAS基因。
STEP 1:構建入門載體
有幾種不同的方法來生成我們想要的入門載體——即兩側為attL位點的人類KRAS基因。
方法A:attB-PCR產物或含attP位點的供體質粒的重組。在這種情況下,我們將使用PCR將attB位點添加到KRAS編碼序列的任意一端。如果您選擇這種策略,載體中應包含適當的蛋白質表達元素(核糖體識別序列,起始密碼子,終止密碼子,閱讀框架等)是非常重要的。
該視頻演示了如何使用Snapgene程序設計Gateway質粒。
(https://www.youtube.com/watch?v=kVm5rC-0Aik)
圖3:方法A構建了一個入門克隆:將aattB-flanked PCR產物與包含attP的供體載體重新組合。
方法B:用TOPO克隆將所需的基因插入到attL-entry-TOPO載體中。TOPO克隆增加了短末端,以便於克隆到含有attL的入門載體中。
圖4:方法B創建了一個入門克隆:TOPO克隆插入到包含attL的進入載體中。
方法C:限制性克隆:對含有目的DNA和attL-入門載體的限制酶片段進行克隆。將目的片段插入含有attL的入門載體的多克隆位點(MCS)中。
圖5:方法C創建了一個入門克隆:將限制克隆插入到包含attL的進入載體中。
專業提示:Addgene有現成的入門載體,可用於許多流行的基因,包括Hs.KRAS4a。使用Addgene網站搜索您喜歡的基因!
STEP 2:構建表達載體
製作表達載體時,選擇最適合您實驗的目標載體非常重要。這種選擇取決於許多因素,如您的微生物,所需的表達水平和實驗目的。對於哺乳動物的慢病毒表達,我們可以使用像pLenti CMV Puro DEST(w118-1)(貨號:#17452)或強力黴素誘導型pLIX_402載體(貨號:#41394)。 選定的attR目的載體將與attL-入門載體重組以產生表達載體。
STEP 3:表達目的基因
一定要通過測序或限制性酶切來驗證表達載體的完整性!然後,您可以將表達載體轉化或轉染到你的實驗細胞中,並驗證您構建的質粒是否發揮功能。
Gateway克隆方法的優點
兼容性和靈活性:一旦您用感興趣的DNA序列構建了入門載體,您可以通過一個重組步驟將DNA片段移動到任何表達系統中。Addgene現成的入門載體可與多種質粒一起使用。
圖6:生成表達式克隆。入門克隆和目的載體之間的反應產生兩個產物:所需的表達克隆和包含ccdB基因的副產物。ccdB產品對細胞有毒性,Gateway克隆效率可達>99%。
快速:Gateway系統僅在1天內即可構建表達載體,而傳統的限制性酶切和連接克隆則需要2天以上。而且該方法可以在同一管中進行BP和LR反應,加速了將attB-PCR產物直接克隆到目的載體中。克隆過程很簡單-不需要限制性酶切,連接或凝膠純化步驟!
多片段克隆:您可以使用Gateway克隆在同一個管中一次將多個DNA片段插入多個載體中。您可以在一個試管中以特定的順序和方向將最多4個DNA片段克隆到一個Gateway載體中以產生所需的表達克隆。這可以歸功於Gateway載體的設計。它修改了可以產生特異性和定向重組的attB,P,L和R位點,:attB1位點僅與attP1位點反應; attB2僅與attP2反應,attL1僅與attR1反應; attL2僅限attR2反應,依此類推。在Addgene可以找到一些多位點Gateway質粒,包括Frew Lab多重慢病毒表達系統(MuLE)試劑盒(貨號:Kit #1000000060),多位點Gateway克隆試劑盒(Kit 貨號:#1000000050)和MultiSite Gateway質粒(https://www.addgene.org/search/advanced/?q=multisite+gateway)。
恆定閱讀框:當您將DNA片段從一個Gateway載體移動到另一個Gateway載體時,插入的DNA片段保持在框架中。
高效:用於Gateway克隆的陽性(抗生素)和陰性(CcdB)篩選標記可將克隆效率提高至> 99%。
普遍性:可以克隆所有類型的DNA片段:PCR片段,cDNA或基因組DNA,且適用於從哺乳動物到大腸桿菌的所有種類的生物。
準備嘗試Gateway克隆嗎?世界上許多科學家已經將他們構建的Gateway兼容質粒存放在Addgene。這些可用於在多種模式生物中表達基因。使用下面的連結查找您感興趣的生物的Gateway質粒:
https://www.addgene.org/search/advanced/?q=Gateway&depositor=&article=&gene=&vector=&tags=&advanced_query=&results_per_page=20&page=1&selected_facets=vector_types_exact%3Amammalian-expression&sort_type=relevance
https://www.addgene.org/search/advanced/?q=Gateway&depositor=&article=&gene=&vector=&tags=&advanced_query=&results_per_page=20&page=1&selected_facets=vector_types_exact%3Abacterial-expression&sort_type=relevance
https://www.addgene.org/search/advanced/?q=Gateway&depositor=&article=&gene=&vector=&tags=&advanced_query=&results_per_page=20&page=1&selected_facets=vector_types_exact%3Ayeast-expression&sort_type=relevance
https://www.addgene.org/search/advanced/?q=Gateway&depositor=&article=&gene=&vector=&tags=&advanced_query=&results_per_page=20&page=1&selected_facets=vector_types_exact%3Aplant-expression&sort_type=relevance
https://www.addgene.org/search/advanced/?q=Gateway&depositor=&article=&gene=&vector=&tags=&advanced_query=&results_per_page=20&page=1&selected_facets=vector_types_exact%3Aworm-expression&sort_type=relevance
https://www.addgene.org/search/advanced/?q=Gateway&depositor=&article=&gene=&vector=&tags=&advanced_query=&results_per_page=20&page=1&selected_facets=vector_types_exact%3Ainsect-expression&sort_type=relevance
Glossary of Gateway Cloning Vectors
Further Reading
1. Chee JY, Chin CF (2015) Gateway Cloning Technology: Advantages and Drawbacks. Clon Transgen 4:138. doi:10.4172/2168-9849.1000138
2. Hartley JL. Use of the Gateway System for Protein Expression in Multiple Hosts. Curr Protoc Protein Sci. 2003 Feb;Chapter 5:Unit 5.17. PubMed PMID:18429245.
3. Ptashne,M(1992). A Genetic Switch: Phage (Lambda) and Higher Organisms (Cambridge, MA: Cell Press).
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