» Northern雜交試驗指導手冊（3）－為製備RNA探針模板的DNA片斷亞克隆
來源：來源網絡 2007-03-20 23:38
A． 載體選擇
為了獲得能夠在體外轉錄RNA探針的DNA模板，其克隆載體必須帶有可供選擇的特異轉錄啟動子，同時，為了獲得理想的Northern雜交試驗結果，載體選擇帶有兩種不同類型而方向相反啟動子的載體，以便在RNA探針製備時同時得到兩條鏈的轉錄探針。
常用的這類載體有：pGEM-3/pGEM-4 ( 2.87kb, SP6/T7 ).
pGEM-3Z ( 2.74kb, T7/SP6 ).
PGEM-3Zf(-) (3.2kb, T7/SP6 ).
Bluescript M13- (2.96kb, T7/T3 ).
按照試驗的經濟有效原則，本試驗選用 Bluescript M13-。
B. 目的DNA序列與載體連接
從所建立的cDNA文庫中挑選出帶有目的DNA片斷的克隆，擴增後提取質粒，採用限制性內切酶處理或採用PCR特異擴增的方法分離出目的DNA片斷；採用標準質粒提取方法提取載體質粒（見黃健試驗）。然後按下列程序進行連接。
試劑及其製備
T4 DNA連接酶
連接緩衝液（可直接購買或配製），10X 緩衝液配方為：
0.5 mol/L Tris-HCl pH 7.8
0.1 mol/L MgCl2
50mmol/L 二硫蘇糖醇（DTT）
ATP 5mmol/L ( 如果直接購買商品緩衝液，有的已加在緩衝液中，但有些需單獨加入)。
BSA 0.25mg/L
PEG (3500~8000均可，在緩衝液中加入2%~3% 的PEG可提高平端連接效率)。
無菌蒸餾水（SDW）
試驗程序
1． 建立以下反應體系（終體積20μl）：
4μl 質粒 ( 50μg/μl)
6μl 目的DNA ( 100μg/μl)
2μl 10X 連接緩衝液
2μl DNA 連接酶
6μl 無菌蒸餾水
2． 反應管置於15℃條件下保溫反應24小時，65℃加熱10min.終止反應。
3．取5～10μl連接反應物用微型凝膠電泳檢測連接效果，其餘反應物於-20℃保存備用。
注意事項
1．保證連接反應中目的DNA與質粒載體的濃度比例在3∶1，因為高濃度的DNA有利於片斷與載體的連接，低濃度的DNA則會增加載體自連。
2．DNA連接酶對溫度敏感，在15℃以上會迅速失活，因此，連接反應的溫度控制必須嚴格。
3．為了保證RNA探針的質量，模板DNA片斷的完整性和純度十分重要，在DNA製備時要嚴格控制。
C．感受態細胞製備（CaCl2法）
試劑及其配製
LB培養基（200ml）：2g胰蛋白凍、1g酵母浸膏、2g NaCl，溶解後調整pH至7～8，定溶到200ml混勻，分裝成50ml/瓶後滅菌4℃保存。
CaCl2 0.1mol/L，4℃保存。
E. coli菌株：JM105或TG1。
試驗程序
1．將單菌落菌株接種於5ml LB培養基中，在37℃條件下振蕩培養過夜。
2．取0.5ml過夜培養的菌液接種於50ml LB培養基中，在37℃條件下振蕩培養約3小時，用分光光度計檢測OD600＝0.3～0.4時，取出培養瓶置於冰上完全冷卻。
3．將菌液轉入離心管中，在4℃條件下，3500rpm離心5～10min.，棄去上清液。
4．將沉澱懸浮於預冷的25ml 0.1mol CaCl2中，在冰上放置30min.後，於4℃條件下，3500rpm離心5～10min.，棄去上清液。
5．沉澱重懸於2ml 預冷0.1mol CaCl2溶液中，菌液直接用於轉化。或加入1.6ml 80%甘油，按每管200μl分裝於2ml的凍存管中，於液氮中速凍後-70℃保存備用。
D. 質粒DNA轉化
試劑及其配製
LB培養基（同C）。
氨苄青黴素：用無菌蒸餾水配製成50mg/ml的貯存液。
含氨苄青黴素（AP）的LB平板：每升LB培養基中加入15g瓊脂，溶化後高壓滅菌，待稍涼後再加入氨苄青黴素至終濃度為50~100μg/ml。在超淨工作檯上用9cm滅菌培養皿鋪板。
IPTG（isopropylthio-β-D-galactoside 異丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：取2g溶於8ml雙蒸水中，定容至10ml，過濾滅菌後-20℃保存。
X – Gal ( 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)：貯存液濃度為20mg/ml，溶於二甲基甲醯胺中，-20℃黑暗保存。
試驗程序
1．取製備分裝好的感受態細胞，置於冰上5min.，加入連接產物10μl，輕輕混勻後置於冰上30min.。
2．然後置於42℃水浴中熱擊細胞50s.，再置於冰上2min.。
3．向各管中加入200μl在37℃下預熱的LB培養基，37℃下振蕩培養1小時。
4．與此同時，將LB平板置於37℃下片刻，每板加入44μl IPTG/X-Gal (4μl IPTG和40μl X-Gal )均勻塗布於平板表面放置約10min.使其吸附滲透。
5．將步驟3中培養的菌液塗布在制好的平板上，吹乾後（在超淨工作檯中放置片刻）置於37℃下培養過夜。含有插入片斷的菌落為白色。
E. 轉化質粒的快速檢測
試劑及其配製
煮沸緩衝液：蔗糖 8％
Triton X-100 1.5%
EDTA(pH 8.0) 50mmol/L
Tris-HCl(pH 8.0) 10mmol/L
LB培養基（同C）
氨苄青黴素（AP）（同D）
試驗程序
1．選取白色單菌落，接種到3ml含AP的LB液體培養基中，37℃下振蕩培養過夜。
2．將培養物等分成2份按菌落編號，每一菌落編號切勿出錯。一份於4℃下保存備用，每一菌落編號切勿出錯。另一份轉入Eppendorf中，7000rmp離心2min.，棄去上清液，吸乾殘留液體。
3．將沉澱菌體細胞懸浮於350μl煮沸緩衝液中，加入25μl溶菌酶後，渦旋混合。
4．將管置於100℃沸水中煮40s.，取出立即在12000rmp條件下離心15min.。
5．取10μl上清液，加入溴酚藍染料後，在0.8%瓊脂糖膠上電泳。
6．在紫外燈下根據分子量檢測插入片斷的完整性。
如果不能確定轉化片斷的大小，則要進一步雜交、測序分析。選取經檢測含有完整目的DNA片斷的菌落，轉接於2ml TB培養基（每升16g胰化蛋白凍/10g酵母提取物/5g氯化鈉）中，37℃下振蕩培養過夜，取850μl菌液加入到一2ml的凍存管中，再加入150μl 50%的甘油，混勻後置於液氮中快速冷凍，再置於-70℃條件下保存。
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