» Protocol of Northern blot
來源：來源網絡 2007-04-24 21:55
Protocol of Northern blot
質粒的轉化和擴增
質粒的鑑定
目的基因片段的切割
3.1樣品雙酶切(175μl水解體系)
DW 115μl
Buffer B(10×) 17.5μl
BaM H 15μl
Pst I 17μl
DNA(MMP-9) 16μl
BSA 4.5μl
37℃水浴，3h。
3.2制膠(1.5%Agarose)
0.6g Agarose+40ml TAE(1×)
3.3電泳
175μl樣品+35μl loading buffer(6×)
Marker 5μl +DW 20μl + 5μl loading buffer(6×)
3.4目的基因片段的回收（按照北京鼎國生物發展中心的DNA純化回收手冊進行）
3.4.1 切取含DNA片段的瓊脂糖（100mg-300mg）搗碎按重量比1：3（DNA片段：溶液B）加入溶液B。
3.4.2 50℃水溶10分鐘，直至膠完全溶化，其間旋渦振蕩三次，瓊脂糖必須完全溶化，如果體積大於500μl，可適當增加溶膠時間，若此時溶液變紅，可加15μl NaAc。（亦可不加）。
3.4.3 將溶液置於離心柱中，靜置1-2分鐘，≥8000rpm離心30S-60S，若一次加不完，可分兩次離心。
3.4.4 倒掉液體，加入500μl溶液C（用無水乙醇1：1稀釋）於離心柱中，8000rpm 30-60S離心，倒掉液體。
3.4.5 用溶液C（用時乙醇1：1稀釋）500μl再洗一遍，8000rpm 離心30-60S。
3.4.6 ≥15000rpm再次離心30S-60S，摔幹剩餘液體。
3.4.7 將離心柱置於新的離心管中，（此時若離心管蓋蓋不住，不影響實驗結果）加入≥50℃預熱30-50μl（取最低值）溶液D，混勻，靜置2分鐘，≥15000rpm離心60S，管底即DNA。
3.4.8 將DNA貯存於-20℃。
3.5目的基因片段的鑑定
3.5.1電泳（看是否為一條帶）
3.5.2 OD值的測定（主要是確定濃度和質量）
子宮組織總RNA的提取（採用Trizol提取法）
4.1勻漿
每50-100mg組織加入1mlTRIzol。樣品體積不能超過10%TRIzol體積。勻漿。此步後加入氯仿前可放於-60℃～-70℃至少一個月。
4.2可選（對富含脂肪、蛋白的樣品而言）
2-8℃，12000rpm，10分鐘。取上清，移入新管。
4.3水相分離
15-30℃孵育5分鐘。然後，加入0.2ml氯仿（每1mlTRIzol）。用力搖15秒，15-30℃孵育2-3分鐘。2-8℃，12000rpm，15分鐘。離心後，RNA在水相。
4.4 RNA沉澱
轉移水相入新管（注意，保留有機相用於DNA和蛋白的提取），加入0.5ml異丙醇（每1mlTRIzol），15-30℃孵育10分鐘。2-8℃，12000rpm，10分鐘。可見RNA沉澱。
4.5 RNA洗滌
棄上清，每1mlTRIzol加入至少1ml 75%乙醇清洗一次沉澱。2-8℃，7500rpm，5分鐘。
4.6溶解RNA
室溫乾燥RNA 5-10分鐘。加入100μl DEPC水重溶RNA。貯存於-70℃。
4.7 RNA的鑑定
測定OD260/280，1.7～2.0為好；電泳，觀察降解與否，照相。
RNA變性凝膠電泳
5.1制膠
溶化適量Agarose於水中，冷卻至60℃，加入5×甲醛凝膠緩衝液（即5×MOPS：0.1M MOPS，40mM乙酸鈉，5mM EDTA）和甲醛（PH＞4.0）至最終濃度分別為1×和2.2M。將膠放在制膠板中，室溫至少30min。
Agarose 0.4g
去離子水 25ml
60℃溶解後，再加入：
5×MOPS 8ml
甲醛 7.3ml
5.2製備樣品
RNA 4.5μl（約10~20μg，RNA體積不足用DEPC水補齊）
5×MOPS 2.0μl
甲醛（約佔20%） 3.5μl
去離子甲醯胺（佔50%） 10.0μl
65℃孵育樣品15min，冰上製冷，離心（樣品）5秒，將所有液體沉澱到微型離心管中。
5.3 加1/10體積（2μl）的無菌、DEPC處理的甲醛凝膠上樣緩衝液（50%甘油，1mmol/L EDTA,0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯青FF）。
5.4 預電泳5V/cm，5分鐘，電泳緩衝液為1×MOPS，預電泳後立即加入樣品。
5.5 電泳緩衝液1×MOPS淹沒凝膠，電壓3~4V/cm（80V，1.5~4h可根據溴酚藍的位置來確定電泳時間，基本上溴酚藍快跑完了）
6．轉膜
6.1 電泳完畢後，用DEPC水清洗5min×3，以去除甲醛，然後浸泡凝膠於20×SSC中45分鐘。
6.2 浸泡尼龍膜於20×SSC中，至少5分鐘。
6.3溼式電轉移
6.3.1將8張合適大小的濾紙、尼龍膜及海綿在電泳緩衝液（0.5×TBE）中浸透（至少10分鐘）。
6.3.2將膠安放在轉移架夾中，注意不要留下氣泡。安放順序為：海綿、4張濾紙（一張一張放，並用吸管及時除去氣泡）、凝膠、尼龍膜、4張濾紙（每放一層都用0.5×TBE溼潤一下）。將轉移架夾緩緩地放置在裝有電泳緩衝液的轉移槽中，使液體慢慢沒夾，驅出海綿中的氣泡。注意：尼龍膜面向正極柵板。
6.3.3轉移：電壓為1-4V/CM。先用8V（1V/CM）轉移1小時，小片段在低電壓下轉移較好。然後升壓至30V（4V/CM），再轉移2小時，使大片段轉移徹底。通過紫外光可檢查轉移效果。
6.3.4結束轉移，取出尼龍膜，在電泳緩衝液中漂洗可能粘附的凝膠，浸泡膜於2×SSC中至少5分鐘（5~30min）。
6.3.5紫外交聯，在基因交聯儀中進行，設定如下參數：
溼膜：150mj，13秒，C3
幹膜：13秒，C2
如需重複雜交時，勿讓膜幹透。
7．cDNA的32P末端隨機引物標記
7.1 變性25ngDNA（適當增大加入量）溶解在5~20μl 蒸餾水中，沸水浴加熱5min，然後立即冰上製冷。
7.2 冰上進行以下操作：
2μl dATP
2μl dGTP
2μl dTTP
10μl 隨機引物緩衝液（Random Primer Buffer）
3μl(約50μCi，[α-32P]dCTP，Mixture)3000Ci/mmol,10μCi/μl
加蒸餾水至總體積49μl，短暫振蕩。
7.3 加入1μlKlenow片段，緩慢且完全混勻，短暫離心。
7.4 25℃溫育1h。
7.5加入5μl終止液。直接用於雜交反應或放於-20℃以備使用，但不可放置太久。
附註：第4步中孵育時間大於1h可以產生較高的特異性。
第5為得到理想結果，超螺旋DNA應在隨機引物標記前線粒化或鹼變性。
8．雜交
8.1 室溫浸泡膜於2×SSC中15分鐘。倒掉液體，加入7.5ml預雜交液。65℃預雜交4h。
8.2 沸水浴200ng cDNA探針（於50μl緩衝液中）5~15分鐘，然後立即在冰水混合物中致冷。離心。
8.3 倒掉預雜交液，加入10ml新鮮配置的雜交緩衝液，內含10%硫酸葡聚糖（dextran）以及32P標記的探針（每次10ml雜交液中加入5μl 32P標記探針）。垂直放入雜交管底部，搖勻。65℃，在雜交爐中轉動雜交25（＞16）小時。
8.4 自然冷卻至室溫，洗膜30分鐘（雜交爐中轉動），洗膜液Ⅰ為1×SSC，0.1%SDS。
8.5 60℃，洗膜液Ⅱ中洗膜3×30分鐘（雜交爐中轉動）。
9．放射自顯影
吸乾多餘的液體，包上可透過紫外線的塑料保鮮膜，在暗室中將雜交膜和X光片放入增感屏內，密封后放在-80℃中，48小時。
10．顯影和定影
暗室中顯影13分鐘，定影30分鐘。
11．洗掉探針
用50mL洗膜液Ⅲ於65℃，2×30分鐘。用2×SSC室溫漂洗5min×2。
Northern Blot 實驗過程中所用到的試劑配方：
—————雜交前————
1．5×MOPS，500ml
0.1M MOPS
0.04M NaAc
0.005M EDTA
在400mL的DEPC水中溶解11.56g MOPS，用HAc或NaOH調節PH至7.0，然後加入2.72g NaAc及5mL 0.5M EDTA，用DEPC水定容至500mL，用0.22μm的濾膜過濾除菌，避光保存。
2．0.5M EDTA（PH8.0），50 mL
EDTA 7.306g
DEPC水 45mL
用NaOH調至PH8.0，補加DEPC水到50 mL
3．甲醛凝膠上樣緩衝液（約20μL，即 loading buffer）
50% 甘油
1mM EDTA（PH8.0）
0.25% 溴酚藍
0.25% 二甲苯青FF
4．1×MOPS，500mL
5×MOPS 100mL
DEPC水 400mL
5．20×SSC，1000mL
3M 175.3g NaCl
0.3M 88.2g 檸檬酸三鈉·2H20（88g/L）
用1M HCL調PH7.0，定容到1000mL
6．2×SSC，500 mL
20×SSC 50mL
DEPC水 450 mL
7．5×TBE ，400mL
21.6克 Tris鹼
11.0克 硼酸
8mL 0.5M EDTA PH8.0
加DEPC水至400mL，出現沉澱後廢棄。
8．1×TBE，1000mL
10×TBE 100mL
DEPC水 900mL
——————雜交時—————
1．2×SSC
2．預雜交液，50mL
DEPC水 30mL
SDS 3.5g
Na2HPO4·12H2O 2.45g
NaH2PO4(NaH2PO4·2H2O) 0.38g(0.494g)
0.5M EDTA 100μL
BSA 0.5g
去離子甲醯胺 7.5mL
加無離子水至50mL
——————雜交後——————
1．洗膜液Ⅰ，500mL
1×SSC 500mL
0.1%SDS 0.5g
2．洗膜液Ⅱ，2000mL(500mL)
NaH2PO4·2H2O 2.465g (0.62g) 25mM
Na2HPO4·12H2O 12.248g (3.06g) 25mM
EDTA 0.584g (0.146g) 1mM
SDS 20g (5g) 1%
加水至 2000mL (500mL)
3．洗膜液Ⅲ，500mL
Na2HPO4·12H2O(10mM) 1.79g
DW to 250mL
約1mL磷酸調PH7.0
去離子甲醯胺(50%) 250mL
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