» Northern雜交試驗指導手冊（2）－RNA質量檢測
來源：來源網絡 2007-03-20 23:37
二、RNA質量檢測
提取的RNA需要對其質量和數量進行檢測。實驗室常用的方法有紫外吸收值檢測和電泳檢測兩種。
方法一、紫外吸收檢測
試劑：TE ( 10mmol/L Tris, 1mmol/LEDTA)。
dH2O
試驗程序
1．預熱紫外分光光度計10～20min.。
2．取兩個1ml的狹縫石英杯，一個裝入1mlTE溶液作為空白校正液，用來校正分光度計零點及調整透光度至100。
3．取4μl RNA待測樣品加入另一比色杯中，加dH2O至1ml，用無菌石蠟膜堵住杯口，倒轉混勻。
4．將兩個比色杯置於分光光度計中，調入射光波長，用空白溶液分別調整T至100、OD至0，然後測定樣品在260nm、280nm、230nm的OD值。
RNA濃度和純度分析
濃度計算：對於單鏈RNA，OD260＝1.0時，RNA濃度為40μg/ml，按照上述稀釋方式，即OD260＝0.1時，其RNA濃度為1μg/ml。
純度分析：純淨的RNA樣品其OD260/OD280的比值應介於1.7~2.0，小於此比值說明有蛋白或苯酚汙染，如果比值大於2.0則可能被異硫氰酸胍汙染；OD260/OD230比值應大於2.0，如果小於此比值說明有小分子及鹽類汙染。
方法二、變性瓊脂糖凝膠電泳檢測
試劑及其配製
MOPS緩衝液（10×）: 200mmol/L MOPS ( pH 7.0 )
50mmol/L NaAc
10mmol/L EDTA
準確稱取41.86g MOPS, 6.8g NaAc, 3.72g EDTA，先用適量的用DEPC處理的水溶解NaAc，再將MOPS溶解其中，再加入已用同樣方法處理水溶解的EDTA，混勻後用2mol/Ld NaOH將調整pH 至7.0，最後定溶至1000ml，過濾滅菌後避光保存。
上樣染料：50%甘油，1mmol/L EDTA，0.4%溴酚藍，0.4%二甲苯藍
其它試劑：甲醛（37%溶液，13.3mol/L）
甲醯胺（去離子）
將10ml甲醯胺和1g離子交換樹脂混合，室溫攪拌1 小時後用Whatman濾紙過濾。等分成1ml於-70℃貯存。
溴化乙錠（EB，10mg/ml）
70%乙醇
試驗程序
1．將制膠用具用70%乙醇衝洗一遍，晾乾備用。
2．配製瓊脂糖凝膠：稱取0.5g瓊脂糖，置於乾淨的燒瓶中，加入40ml蒸餾水，微波爐內加熱溶化均勻。
3．待膠涼至60~70℃時，依次向其中加入9ml甲醛、5ml 10×MOPS緩衝液和0.5μl溴化乙錠，混合均勻後立即灌膠（注意避免產生氣泡）。
4．樣品製備：取DEPC處理過的500μl小離心管，依次加入10×MOPS緩衝液2μl、甲醛3.5μl、甲醯胺（去離子）10μl、RNA樣品4.5μl，混合均勻；將離心管置於60℃水浴中保溫10min.，再置於冰上2min.；向每管中加入3μl上樣染料，混勻。
5．上樣：將製備好的凝膠放入電泳槽中（上樣孔一側靠近陰極），加入電泳緩衝液（1×MOPS緩衝液），液面高出膠面1～2mm，小心拔出梳子使樣品孔保持完好。用微量移液器將製備好的樣品加入加樣孔，每孔上樣20～40μl。
6．電泳：蓋上電泳槽，接通電源，樣品端接負極，於7.5V/ml的電壓下電泳2小時左右，當溴酚藍到達凝膠底部時停止電泳。電泳結束後，即可在紫外燈下檢測結果。
RNA樣品質量分析：
完整的總RNA樣品應呈現出三條條帶，分別為28S rRNA、18S rRNA、5S rRNA。其中28S rRNA條帶的亮度應約為18S rRNA條帶亮度的2倍，這表明RNA樣品比較完整，基本無降解。如果兩條帶的亮度反過來，則說明RNA樣品已發生降解。如果在點樣槽內或槽附近有螢光區帶，則表明RNA樣品中有DNA汙染。
植物總RNA中28S rRNA及18S rRNA在變性膠上的遷移率相當於分子量5.1kb及2.0kb RNA的遷移率，以此可作為分子量的參考。
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