連接混合物中純化的靶DNA與切割的質粒載體摩爾比應為約1:1

2020-12-06 跟著大金來看劇

如Wizard SV Gel和PCR Clean-Up System(Promega公司)、PureLink PCR純化試劑盒(Life Technologies公司)或QIAquik PCR純化試劑盒(QIAGEN 公司)。

1.使用按本方案材料部分概述方法設計的正向和反向引物產生100~ 200ng擴增目的片段。取少量樣品(約25ng)通過瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增產物的大小。

2.用酚：氯仿抽提和乙醇沉澱，或通過使用商業產品如Wizard sV Gel 和PCRClean-Up System (Promega公司)、PureLink PCR純化試劑盒(Life Technologies公司)或QIAquik PCR 純化試劑盒(QIAGEN)， 純化PCR擴增的DNA。純化的PCR產物溶解在20uL∞TE (pH7.5) 中。

3.在20μuL°反應體積中，用1.0~2.0U相關限制性內切核酸酶消化約50ng純化的PCR產物。在最適溫度溫育反應物1h.

4.消化結束時，按步驟2所概述方法純化DNA.

5.將DNA溶解在10μL°水中。

6.在一個微量離心管中建立以下連接混合物：如果有必要，添加ATP至終濃度為1mmol/L。建立對照反應，包含上述列出的所有試劑，除了擴增的靶DNA。連接混合物中純化的靶DNA與切割的質粒載體摩爾比應為約1:1

7.在16C溫育連接混合物2h。

8.分別用10μL四水稀釋5uL°兩種連接混合物，轉化合適的抗生素耐藥性的感受態大腸桿菌菌株。

相關焦點

  • 質粒DNA的分離、純化和鑑定
    在製作酶譜、測定序列、製備探針等實驗中需要高純度、高濃度的質粒DNA,為此需要大量提取質粒DNA。大量提取的質粒DNA一般需進一步純化,常用柱層析法和氯化絕梯度離心法。提取過程中應儘量保持低溫。　　2. 加入溶液II和溶液III後操作應混和,切忌劇烈振蕩。　　3. 由於RNA酶A中常存在有DNA酶,利用RNA酶耐熱的特性,使用時應先對該酶液進行熱處理(80℃1小時),使DNA酶失活。
  • 質粒DNA的提取與純化
    質粒DNA的提取與純化 來源：來源網絡 2007-04-02 16:28 一、實驗目的與原理質粒多為一些雙鏈、環狀的DNA分子，是獨立於細菌染色體之外進行複製和遺傳的輔助性遺傳單位
  • siRNA質粒載體構建
    siRNA 質粒載體的構建RNA 小片段可以通過化學合成或質粒載體轉錄獲得。質粒載體的構建是將長約70bp的含有特定莖環以及終止信號的DNA分子插入到特定載體中，該DNA分子可以 在細胞中轉錄為含有特定髮夾結構的RNA雙鏈分子。這些髮夾RNA分子在細胞中被切割為19-23nt的雙鏈RNA小片段，從而起到抑制特定基因表達的作用。
  • 質粒載體構建服務
    基因編輯原理CRISPR/Cas9系統是一種原核生物的免疫系統，是細菌用來抵抗病毒和外源質粒入侵的一種防禦機制。目前最成熟且應用最廣的是Type II的CRISPR/Cas9系統，其原理是利用gRNA特異性識別靶序列，並引導Cas9核酸內切酶對靶序列的PAM上遊進行切割，從而造成靶位點DNA雙鏈斷裂，隨之利用細胞的非同源末端連接（NHEJ）或同源重組（HDR）的方式對切割位點進行修復，實現DNA水平的敲除、敲入或點突變。
  • 在純化質粒DNA的過程中,有些成分阻礙限制酶的功能
    設計螢光標記的寡核苷酸，用於上下遊未標記引物所擴增靶序列的復性。由具有5'→3'外切酶活性的熱穩定DNA聚合酶(如Taq)催化的DNA合成可引起探針的水解以及雷射照射後螢光強度增加。目前已經有商業化試劑盒利用TaqMan Universal PCR Master Mix完成5'核酸酶檢測，這類試劑盒中含有預稀釋的系列濃度的DNA參照品。在質粒DNA的製備過程中遇到的任何問題，在隨後的限制性酶切分析中會更加明顯。問題(步驟15):在酶切前、後經電泳只見很少或無DNA。
  • 拷貝數的巨大差異,黏粒DNA的得率比常規的高拷貝數質粒要低得多
    例如，通過合適的稀有限制性內切核酸酶進行切割，或利用入噬菌體DNA末端酶/包裝系統。腺病毒重組DNA轉染到培養的合適品系的哺乳動物細胞，產生重組腺病毒的原種。欲了解更多詳細信息和文獻引用，見第16章。黏粒資源一些公司 (例如Stratagene/Agilent公司和Epicentre Technologies 公司)以試劑盒形式銷售黏粒載體和包裝混合物以及細菌菌株。與質粒DNA轉化大腸桿菌(見方案1~4)相同的技術可用於轉化黏粒。從轉化細菌培養物分離和純化黏粒DNA的技術基本上與常規質粒所使用的技術相同：鹼裂解從宿主細菌釋放出黏粒，然後通過商業化樹脂結合和洗脫純化。
  • DNA重組技術的基本工具(1)
    Smith)在細菌中發現了第一個限制性內切酶（簡稱限制酶）後，20世紀70年代初相繼發現了多種限制酶和連接酶，以及逆轉錄酶，這些發現為DNA的切割、連接以及功能基因的獲得創造了條件。限制性核酸內切酶——「分子手術刀」切割DNA的工具是限制性核酸內切酶（restrictionen donucleases)，又稱限制酶（restriction enzyme）。這類酶主要是從原核生物中分離純化出來的。迄今已從近300種不同的微生物中分離出了約4000種限制酶。
  • 防止限制性內切核酸酶消化連接反應過程中產生的重組體
    限制性內切核酸酶的作用是在限制位點切割質粒分子自連接產生的環狀和線性多聯體。該方法需要質粒與靶DNA分子的連接破壞限制性酶切位點，以防止限制性內切核酸酶消化連接反應過程中產生的重組體。單位長度線性載體分子持續再生的淨效應，推動連接反應的平衡狀態強烈偏向於載體和插入物之間形成重組體。因為載體DNA的再生、連接、所有PCR產生的DNA片段的末端補平都同時發生在同一反應混合物中，該方法非常高效。14 DNA理按酶3U調整H2O的加入量，使最終的反應體積為20μL°設置對照反應，包含.上述列出的所有試劑，除了擴增的靶DNA。
  • 該策略利用的是閉環DNA轉化細菌細胞的頻率比線性DNA高得多的現象
    大多數常用的質粒載體中含有多克隆位點，實質上是許多不同的限制性內切核酸酶識別序列的簇。鑑於目前多克隆位點種類繁多(一些多接頭含有多達46個獨特位點，例如Life Technologies 公司的pSE280; 更長的多接頭也已組裝： Brosius, 1992)， 幾乎總是可以找到一個攜帶獨特的限制性位點的質粒載體，可以與一個特定外源DNA片段的末端兼容。定向克隆通常需要線性化載體的兩端含有突出末端：①與另一個不一致②與靶DNA的末端一致。
  • 裸質粒載體在基因治療藥物中的應用
    基因治療是二十世紀九十年代發展起來的一種全新的疾病治療模式，是通過載體將外源基因導入靶細胞，以糾正或改善致病基因所產生的缺陷，達到治療疾病的目的。裸質粒基因治療藥物的研發現狀裸質粒基因治療藥物是以裸質粒作為目的基因載體開發的藥物，是較為常見的一種基因治療形式。目前全球範圍內以裸質粒DNA為載體的基因治療臨床試驗共開展了442個，排名第三；與以腺病毒和逆轉錄病毒為載體的臨床試驗數量基本相當。
  • 通過兩種限制性內切核酸酶在不同序列切割,產生不同的末端
    用兩種合適的限制性內切核酸酶消化載體(10μg) 和外源DNA。製備閉合環狀質粒軟體用於定向克隆，通過兩種限制性內切核酸酶在不同序列切割，產生不同的末端。只要可能。儘量避免使用多克隆位點上切割序列相互之間位於12bp 以內的兩種限制性內切核酸酶，因為在其中一個位點被切割後，第二個位點將太接近線性DNA的末端，從而不利於第二種酶的有效切割。
  • DNA重組技術的基本工具
    考點：可以對DNA進行切割的「分子手術刀」：限制性核酸內切酶切割DNA的工具是限制性核酸內切酶又稱限制酶，這種酶主要是從原核生物中分離，純化出來的，它能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定核酸序列定時每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開
  • 重組DNA技術(分子克隆)技術方案
    已經從250 多種微生物中分離到約400 種限制性核酸內切酶，它們識別的DNA序列一般含4～6 個核苷酸，切割時有的產生平頭末端，有的產生粘性末端。限制性核酸內切酶是基因操作中最重要的工具酶。 　　2.DNA連接酶能將兩個DNA片段拼接起來的酶叫做DNA連接酶。DNA 連接酶不但在DNA複製(如岡崎片段的連接)和DNA修復中起作用，在DNA的體外重組中也用於連接兩個DNA的片段。
  • 新手入門:質粒的轉化,滿滿乾貨|細胞|培養液|培養基|dna_網易訂閱
    在基因工程中，用於轉化的受體菌（Restriction-Modification 缺陷變異株，以防止對導入外源DNA進行切割）一般通過誘導的方式實現。主要原理就是通過處理使細胞的通透性變大，直觀的說，使得細胞膜表面出現一些孔洞，便於外源基因或載體進入感受態細胞。由於細胞膜的流動性，這種孔洞會被細胞自身所修復。
  • Plasmidselect Xtra---超螺旋質粒DNA純化的首選
    這些新產品有力的補充了GE Healthcare現有的高質量純化，分析和定量質粒DNA的技術平臺，為基因治療和DNA疫苗的生產提供可更有力的工具。PlasmidSelect Xtra 可吸附>2 mg/ml 6125 鹼基的超螺旋質粒DNA。
  • MPB:華中農大謝卡斌組-CRISPR靶向消除16S-seq中植物序列的方法
    該方法操作簡單，可以方便地整合到已有的16S-seq流程中，能高效率地消除共擴增的高豐度植物序列。我們的分析也表明Cas9具有高特異性，通過使用我們開發的生物信息學平臺設計的植物特異的gRNA，未檢測到脫靶切割細菌16S rRNA的現象。本文以水稻為例，描述了Cas-16S-seq的詳細步驟和實驗要點，為科研人員使用該方法分析植物微生物組提供參考。
  • 質粒DNA提取及瓊脂糖凝膠電泳
    將質粒指紋圖譜分析方法、質粒DNA探針技術及檢測質粒的PCR技術用於臨床感染性疾病的診斷和流行病學調查已成為現實。質粒作為載體在基因工程中起著重要的作用。　　分離和純化質粒DNA的方法很多,但這些方法基本包括三個步驟：即細菌的培養和質粒DNA的擴增，細菌菌體的裂解; 質粒DNA的提取與純化。　　本實驗學習用鹼變性方法提取質粒DNA。
  • 在該方法中,重疊序列被設計引入用於擴增靶DNA和載體的PCR引物
    載體和PCR產物的序列是經過設計的，以保證四種鹼基中的其中一種不會出現在3'端的前12個核苷酸中。在這種dNTP存在的情況下，通過T4 DNA聚合酶的3'→5'外切核酸酶活性可以產生指定長度的互補尾巴。
  • 閱讀質粒圖譜
    質粒一般只能容納小於10Kb的外源DNA片段。一般來說，外源DNA片段越長，越難插入，越不穩定，轉化效率越低。第五步：是否含有表達系統元件，即啟動子－核糖體結合位點－克隆位點－轉錄終止信號。這是用來區別克隆載體與表達載體。克隆載體中加入一些與表達調控有關的元件即成為表達載體。選用那種載體，還是要以實驗目的為準繩。