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Cas-16S-seq：利用CRISPR/Cas9靶向消除16S-seq中高豐度植物序列的方法
Cas-16S-seq: Using CRISPR/Cas9 to Eliminate Abundant Plant Sequences in 16S-seq
宋露洋，謝卡斌*
作物遺傳改良國家重點實驗室，作物病害監測和安全控制湖北省重點實驗室，華中農業大學，武漢
*通訊作者郵箱: kabinxie@mail.hzau.edu.cn
摘要：16S rRNA基因高通量測序 (16S-seq) 是研究微生物組的常用方法之一。在分析植物或其他高等生物的樣品時，線粒體和質體16S rRNA基因也被通用引物擴增，造成測序結果中宿主序列的汙染最高達99%以上，不僅提高了成本，而且極大地限制了16S-seq方法分析植物微生物群落結構的靈敏度。Cas-16S-seq的方法是一種利用CRISPR/Cas9靶向切割植物16S rRNA基因序列從而富集擴增產物中細菌序列的方法 (圖1) (Song和Xie，2020)。該方法操作簡單，可以方便地整合到已有的16S-seq流程中，能高效率地消除共擴增的高豐度植物序列。我們的分析也表明Cas9具有高特異性，通過使用我們開發的生物信息學平臺設計的植物特異的gRNA，未檢測到脫靶切割細菌16S rRNA的現象。本文以水稻為例，描述了Cas-16S-seq的詳細步驟和實驗要點，為科研人員使用該方法分析植物微生物組提供參考。
關鍵詞：16S rRNA基因高通量測序 (16S-seq)，CRISPR-Cas，宿主汙染，微生物組，植物
材料和試劑
1.50 ml離心管 (Corning, catalog number: 430829)
2.RNase-free 0.2 ml PCR管 (Axygen, catalog number: PCR-02D-C)
3.RNase-free 1.5 ml離心管 (Axygen, catalog number: MCT-150-C)
4.丁腈手套 (AMMEX, catalog number: APFNCHD50)
5.Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIP) (New England Biolabs, catalog number: M0290S)
6.Bsa I (New England Biolabs, catalog number: R0535S)
7.Cas9 (New England Biolabs, catalog number: M0386S)
8.DH5α (Vazym, catalog number: C502-03)
9.Protease K (New England Biolabs, catalog number: P8107S)
10.T4 DNA ligase (New England Biolabs, catalog number: M0202S)
11.T4 polynucleotide kinase (T4 PNK) (New England Biolabs, catalog number: M0201S)
12.pUC19-gRNA (Addgene plasmid #137776，質粒圖譜見圖1)
圖1. pUC19-gRNA載體示意圖
13.16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit (TaKaRa, catalog number: RR176)
14.Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter, catalog number: A63880)
15.DNeasy Powersoil Kit (QIAGEN, catalog number: 12888-50)
16.Gel Extraction Kit (OMEGA, catalog number: D2500-02)
17.HiScribe Quick T7 High Yield RNA Synthesis Kit (New England Biolabs, catalog number: E2050)
18.I-5 2× High-Fidelity Master Mix (Molecular Cloning Laboratories, catalog number: I5HM-200)
19.QIAGEN plasmid mini kit (QIAGEN, catalog number: 12123)
20.RNA Clean & Concentrator Kit (Zymo Research, catalog number: R1017)
21.Double-distilled H2O (ddH2O)
22.KCl (Fisher Scientific, catalog number: P217-500)
23.KH2PO4 (Fisher Scientific, catalog number: P285-500)
24.LE Agarose (Hydragene, catalog number: R9012LE-100g)
25.NaCl (Fisher Scientific, catalog number: S271-1)
26.Na2HPO4 (Fisher Scientific, catalog number: S374-500)
27.TWEEN 20 (Fisher Scientific, catalog number: BP337-100)
28.75%乙醇，80%乙醇 (用95%乙醇和0.1‰ DEPC處理水配製)
29.75%醫用酒精 (國藥試劑)
30.氨苄青黴素 (國藥試劑)
31.苯酚 (國藥試劑)
32.焦碳酸二乙酯 (DEPC, Sigma, catalog number: D5758)
33.氯仿 (國藥試劑)
34.無核酸酶水 (Zymo Research, catalog number: W1001-4)
35.無水乙醇或95%乙醇 (國藥試劑，分析純)
36.無水乙酸鈉 (國藥試劑，分析純)
37.液氮
38.磷酸鹽緩衝溶液 (見溶液配方)
39.0.1‰ DEPC處理水 (見溶液配方)
40.3 M 醋酸鈉 (pH 5.2) (見溶液配方)
儀器設備
1.96孔磁鐵架 (BORHEE, catalog number: MAG-96-11)
2.剪刀和鑷子
3.研磨缽和研磨棒
4.移液器 (2.5，20，200，1,000 μl) (Labnet, catalog numbers: 540910296, 340930114, 240750135, 440960631)
5.NanoDrop One (Thermo Fisher Scientific, catalog number: ND-ONE-W)
6.DNA電泳裝置
7.超淨工作檯
8.小型離心機 (Eppendorf, catalog number: 022620498)
9.臺式離心機 (Cence, catalog number: TDZ5-WS)
10.渦旋振蕩器 (Scientific Industries, catalog number: G560E)
11.水浴鍋
12.37 °C恆溫培養箱
13.PCR熱循環儀 (Bio-Rad Laboratories, S1000TM Thermal Cycler, catalog number: 1852148)
14.研缽和研磨棒
15.-20 °C冰箱
16.pH計 (METTLER TOLEDO, catalog number: FE20K)
軟體和資料庫
1.VSEARCH軟體 (version 2.8.1)
實驗步驟
Cas-16S-seq是將CRISPR/Cas9系統與現有的16S rRNA基因高通量測序 (16S-seq)進行結合，利用CRISPR/Cas9靶向切割特定序列的能力，從而在16S rRNA基因擴增子文庫構建過程中去除大量共擴增的宿主序列(圖2) (Song和Xie，2020)。其中CRISPR是「成簇和規律間隔的短迴文序列」的簡稱，而Cas是指與CRISPR RNA結合的蛋白。在不同的CRISPR-Cas系統中，化膿性鏈球菌Cas9 (Strepcococcus pyogenes Cas9)被廣泛應用於基因組編輯中，而本文提到的Cas9均表示來自化膿性鏈球菌的Cas9。本文以799F-1193R擴增16S rRNA基因V5-V7片段為例，介紹了Cas-16S-seq中gRNA設計、體外合成、植物根系DNA純化、Cas9處理和PCR擴增的詳細步驟，該方法也適用於其他16S rRNA通用引物的擴增子測序分析。
圖2. Cas-16S-seq實驗流程示意圖
一、gRNA設計
Cas9核酸酶可以在一個人造的小RNA分子 (稱為gRNA, 即Guide RNA)的引導下去靶向切割DNA雙鏈 (Jinek等，2012)。其中利用Cas9/gRNA標靶特定的DNA位點只需滿足2個條件：(1) gRNA的5′端20nt (Nucleotides)的嚮導序列 (稱為Spacer或Guide sequence) 與靶DNA位點的序列 (稱為Protospacer) 互補匹配；(2) 靶位點必需存在PAM (Protospacer-adjacent motif)，其中使用最廣的化膿鏈球菌Cas9的PAM序列為5′-NGG-3′。根據Cas9/gRNA靶向切割DNA雙鏈的條件，因此可以通過替換gRNA 5′端20nt (Nucleotides)的嚮導序列，從而使Cas9能被重編程去切割任何的包含有5′-N20-NGG-3′ (N代表任何核苷酸) DNA序列，其中N20與gRNA嚮導序列相同的20個鹼基，NGG是Cas9發揮活性必需的PAM。近年來對Cas9介導的基因組編輯的廣泛研究，也闡明了CRISPR/Cas9的靶向規律 ( Hsu等，2013；Pattanayak等，2013；Kuscu等，2014)，Cas9/gRNA不僅能有效的剪切與gRNA完全匹配的DNA片段，而且也能脫靶到與gRNA部分匹配的DNA片段，因此Cas-16S-seq方法的關鍵步驟是設計能夠區分宿主和細菌16S rRNA基因的高特異性gRNA。本文以水稻16S rRNA基因為例，簡要地介紹了Cas-16S-seq所需gRNA的設計流程 (圖3)。
圖3. CRISPR/Cas9靶位點 (即gRNA設計) 分析流程圖
1.從公共資料庫下載高質量的原核生物16S rRNA基因序列。這些資料庫包括RDP (Cole等，2014)，SILVA (Quast等，2013)，和GreenGenes (McDonald等，2012)等。本研究使用RDP資料庫 (RDP release 11, update 5, https://rdp.cme.msu.edu/, release 11)的細菌16S rRNA序列作為參考。
2.從NCBI資料庫中查找和下載水稻栽培品種Nipponbare參考基因組葉綠體和線粒體16S rRNA基因序列 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gen-ome/10)。
3.提取水稻線粒體和葉綠體16S rRNA基因序列中PAM (5′-NGG-3′) 前的所有的20 bp序列作為mt-gRNA (靶向線粒體序列) 和cp-gRNA (靶向葉綠體序列) 的嚮導序列。
4.從RDP資料庫的3,356,809個原核16S rRNA基因序列中提取5′-NGG-3′和5′-NAG-3′ PAMs (Cas9也能低效率的識別和切割含NAG序列PAM的靶位點) 前的所有20 bp序列。
5.將步驟3和步驟4挑選出的20 bp序列利用VSEARCH軟體 (version 2.8.1) 進行序列比對，此處使用的是全局比對算法。
6.根據圖3的標準鑑定脫靶到RDP-rRNA中原核生物16S rRNA基因序列的cp-gRNA和mt-gRNA。計算每個gRNA脫靶到的RDP-rRNA中原核生物16S rRNA基因序列的數量，並根據脫靶的數量對gRNA特異性進行排序。
註：在分析cp-gRNAs特異性時，需要注意RDP資料庫中含有葉綠體序列，可分析過程中可以把RDP中葉綠體序列排除在外。具體的設計靶向宿主16s rDNA特異性的gRNA的生物信息學代碼流程存儲在Github (https://github.com/KabinXie/Cas-16S-seq/tree/master/gRNA-design)。
二、gRNA的合成
使用含有T7啟動子和gRNA scaffold序列的質粒載體 (如圖2)，然後通過PCR獲得僅含有T7啟動子gRNA的DNA模板用來體外轉錄合成gRNAs，gRNA的克隆方法參考(Xie等，2014)。
1.引物設計和合成。根據圖2所示，對每一個gRNA合成兩條互補的引物：
Forward oligo (正向引物):
5′-TAGG-N1N2N3N4N5N6N7N8N9N10N11N12N13N14N15N16N17N18N19N20-3′
Reverse oligo (反向引物):
5′-AAAC-N1N2N3N4N5N6N7N8N9N10N11N12N13N14N15N16N17N18N19N20-3′
註：引物中TAGG和AAAC是和pUC19-gRNA匹配的接頭序列，N代表任意鹼基，正向引物中第3個G是T7聚合酶的轉錄起始位點。正向引物中20個N表示與靶位點相同的引導序列；反向引物中N表示與靶位點互補的鹼基序列。
2.利用Bsa I對pUC19-gRNA載體進行酶切，反應體系如下。
pUC19-gRNA
2 μg
10× NEB Buffer 4
2 μl
10× BSA
2 μl
Bsa I (10 U/μl)
1 μl
Add ddH2O to
20 μl
3.37 °C孵育2~4小時。
4.(可選步驟) 加入0.5 µl的CIP (5 U/μl) 對步驟1酶切的質粒進行去磷酸化，37 °C孵育30分鐘。
5.利用QIAquick PCR purification kit純化酶切的質粒載體，純化操作按照說明書進行，最後一步加入30 μl Elution buffer溶劑進行DNA的洗脫。
6.利用NanoDrop測定DNA濃度。
7.對於每個gRNA，將合成的單鏈DNA寡核苷酸 (如步驟1所示) 退火為雙鏈DNA寡核苷酸。
Forward oligo (100 µM)
1 µl
Reverse oligo (100 µM)
1 µl
10× T4 DNA ligase Buffer
1 µl
T4 PNK (10 U/µl)
0.5 µl
Add ddH2O to
10 µl
註：如果步驟4沒有使用CIP處理，T4 PNK在此處可以忽略，而且下一步中37 °C孵育步驟也可忽略。
8.使用以下程序在PCR熱循環儀中孵育。
37 °C
60 min
95 °C
10 min
Cool down to 25 °C at 0.1 °C/s
約 12 min
25 °C
5 min
9.將退火形成的雙鏈DNA寡核苷酸按照1:200的比例進行稀釋。
10.將稀釋的雙鏈DNA寡核苷酸與載體進行連接反應，反應體系如下：
Bsa I digested vector
n µl (~50 ng)
Oligo-duplex (diluted)
1 µl
10× T4 DNA ligase Buffer
0.5 µl
T4 DNA ligase (400 U/µl)
1 µl
Add ddH2O to
5 µl
11.室溫 (25 °C) 孵育2~4小時，或者4 °C連接過夜。
12.取1 µl連接產物加入到大腸桿菌DH5α細胞進行轉化。
13.挑取2~4個單克隆在添加有氨苄青黴素 (50 µg/ml) 的LB培養基中進行培養。
14.使用QIAGEN plasmid mini kit提取質粒。
15.使用M13R (-48)引物進行Sanger測序，確認gRNA靶序列正確。
16.使用正向引物M13F (5』-GGTAACGCCAGGGTTTTCC-3』)和反向引物gRNA-R (5』-AAAAGCACCGACTCGG-3』)從構建的質粒載體上擴增帶有T7啟動子和靶序列的gRNA片段，擴增體系如下所示。
Plasmid (步驟15測序正確)
1 ng
I-5 2× High-Fidelity Master Mix
25 μl
M13F (10 μM)
2 μl
gRNA-R (10 μM)
2 μl
Add ddH2O to
50 μl
17.運行如下PCR程序：
98 °C預變性2分鐘；擴增35個循環：98 °C變性10秒, 55 °C退火30秒，72 °C延伸10秒；循環完成後72 °C放置5分鐘。
18.利用1.5%瓊脂糖凝膠進行PCR產物凝膠純化。利用OMEGA凝膠提取試劑盒回收正確大小(~190 bp)的DNA條帶，操作步驟按試劑盒說明書進行，最後使用25 μl Elution buffer溶劑進行DNA的洗脫。
19.將凝膠回收產物用苯酚：氯仿進行抽提純化，去除RNA酶 (以下步驟需使用RNase-free的試劑和耗材)。
19.1DNA溶液中加入等體積 (25 μl)的1:1苯酚：氯仿混合液，渦旋混合30秒；10,000 × g室溫離心5 min，吸取上清到新離心管中。
19.2用等量的氯仿抽提兩次去除殘留的苯酚 (同步驟19.1)。
19.3加入1/10體積 (5 μl) 醋酸鈉 (pH 5.2，3 M) (DEPC處理水配製) 和兩倍體積的無水乙醇。-20 °C放置至少30分鐘。
19.412,000 × g離心15分鐘沉澱收集DNA，並去除上清液。
19.5加入500 µl的75%乙醇 (DEPC處理水配製)，12,000 × g離心15分鐘，移去上清液。
19.6晾乾並加入10~15 µl無核酸酶水溶解DNA。
19.7利用NanoDrop測定DNA濃度。
註：為防止經過切膠回收和苯酚氯仿抽抽提純化後濃度可能會過低，建議步驟16同時配製2~3個PCR擴增體系 (總體積100 μl以上)，保證最終純化後DNA濃度在10 ng/μl以上。
20.將苯酚:氯仿抽提純化的DNA片段作為模板，利用HiScribe Quick T7 High Yield RNA Synthesis kit進行體外轉錄。在離心管中加入以下試劑：
Nuclease-free H2O
18-n µl
NTP Buffer Mix
10 µl (6.7 mM each NTP final)
Template DNA
n µl (75 ng)
T7 RNA Polymerase Mix
2 µl
Total reaction volume
30 µl
註：本體外轉錄反應適合小RNA分子 (gRNA) 的體外轉錄，反應需使用無核酸酶的試劑和耗材，避免RNA核酸酶的汙染。
21.37 °C孵育16個小時。
22.gRNA轉錄體系中加入20 µl無核酸酶水，吸打混勻後再加入1 µl DNase I (2 U/µl), 37 °C繼續孵育15分鐘，酶解DNA模板。
23.利用RNA Clean & Concentrator Kit進行純化體外轉錄的gRNA。操作步驟按試劑盒說明書進行。最後一步加入15 µl無核酸酶水洗脫後，利用NanoDrop進行RNA的濃度測量 (濃度約為4,000 ng/µl)。
註：為了評估所合成gRNA的長度和完整性，可通過變性聚丙烯醯胺凝膠電泳分析轉錄產物。
三、植物根系樣品的分離和基因組DNA純化
1.水稻根系取樣方法。戴上丁腈手套並利用75%醫用酒精進行消毒，握住水稻嫩枝直接拔取種植在田間水稻全株根系，避免對根系組織造成損傷。利用75%醫用酒精對剪刀和鑷子進行消毒，剪取根系後利用鑷子將根系置於含有25 ml TWEEN 20 (0.1%) 的磷酸鹽緩衝溶液的50 ml無菌管中。每取一次樣品時，需利用75%醫用酒精對鑷子和剪刀進行消毒，並利用無菌濾紙擦拭乾淨。將取得樣品迅速置於冰上運回實驗室，樣品不得置於冰上超過24小時。運回實驗室的根系樣品應迅速置於-20 °C (最好置於-80 °C)，且樣品不得反覆凍融。
2.將凍存在-20 °C的根系樣品取出之後置於4 °C解凍樣品，在超淨工作檯進行根系的清洗。首先，將解凍的根系取出放置在裝有25 ml無菌雙蒸水的50 ml無菌離心管中，漂洗去除表面附著的土壤顆粒，然後利用75%醫用酒精消毒的鑷子將根系取出後置於裝有25 ml 含有TWEEN 20 (0.1%) 的磷酸鹽緩衝溶液的50 ml無菌的離心管中，置於渦旋儀上渦旋30秒，重複渦旋清洗水稻根系3次以上，直到根系表面無清晰可見的土壤顆粒，臺式離心機離心 (1,000 × g，15分鐘)，用75%醫用酒精消毒的鑷子取出根系，最後在無菌的濾紙上將水稻根系擦乾。將根系樣品裝入空的50 ml無菌的離心管中，置於-20 °C保存至DNA提取。
3.在提取水稻根系樣品DNA之前，需要用液氮冷凍處理，然後再在研磨缽中充分研磨均勻。
註：研磨缽和研磨棒以及液氮是主要汙染來源，需要經過多次雙蒸水清洗以及高溫高壓滅菌處理 (或酒精灼燒)，防止細菌或殘留植物組織汙染，同時在整個取樣，根系清洗以及研磨的過程中均要設置空白對照組，監測試驗過程中是否帶入細菌汙染。
4.按照DNeasy Powersoil Kit的使用說明進行DNA的提取。DNA的濃度使用NanoDrop進行測量。
註：如樣品量少，在最後一步加入30 µl的C6溶液進行DNA的洗脫。
四、16S rRNA一輪擴增
Cas-16S-seq文庫構建採用兩步PCR法。
1.第一步PCR，利用16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit擴增16S rRNA的V5-V6-V7區，本研究使用含接頭序列的通用引物為Rd1+799F和Rd2+1193R，引物的全長序列見下表。
Primer Name
Sequence (5』>3』)
Rd1+799F
TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG
AACMGGATTAGATACCCKG
Rd2+1193R
GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG
CGTCATCCMCACCTTCCTC
註：下劃線標註的分別為Read1測序引物序列 (Rd1) 和Read2測序引物序列 (Rd2)，其中合成的引物需ULTRAPAGE方法進行純化，需用16S-free的水稀釋引物。
2.按照下表準備擴增體系 (此步需要在超淨工作檯中進行)：
Template DNA
50~100 ng
PCR Premix
12.5 μl
Forward Primer (Rd1+799F) (10 μM)
0.25 μl
Reverse Primer (Rd2+1193R) (10 μM)
0.25 μl
Add 16S-free H2O to
25 μl
註：使用滅菌處理的RNase-free槍頭和PCR管，陰性對照使用16S-free的水為模板。
3.運行以下降落式PCR程序：
94 °C變性3分鐘；擴增34個循環：94 °C變性1分鐘，退火1分鐘，72 °C延伸45秒；循環完成後72 °C放置10分鐘。退火的溫度被設定為60 °C進行4個循環，58 °C進行6個循環，56 °C進行8個循環，54 °C進行8個循環，52 °C進行8個循環。
4.取5 μl的PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳。其中共擴增的水稻線粒體PCR產物條帶大小比細菌大約84 bp，陰性對照無條帶 (圖4)。
圖4. 16S rRNA第一輪PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳結果.
#1-#3代表生物學重複，H2O表示16S-free水為模板的對照，*代表的是水稻線粒體Rd1+799F-Rd2+1193R擴增條帶。
5.利用AMPure XP磁珠純化PCR產物 (此步驟需使用RNase-free的試劑和耗材)
5.1將純化磁珠從4 °C取出放置在室溫 (~25 °C)，約30分鐘使其恢復到室溫，並在渦旋儀上進行充分混勻30秒。
5.2加入0.8倍PCR產物體積的Ampure XP磁珠於PCR產物中，利用移液器輕柔的混勻 (遠離磁鐵架)，室溫孵育15分鐘。
5.3將其放置在磁鐵架上5分鐘。
5.4小心移除上清液，不要吸取到磁珠。
5.5向PCR管中加入200 μl新配的80%乙醇 (DEPC水配製)，並且保持其在磁鐵架上，室溫孵育30秒，利用移液器小心移除上清液。重複此操作一次，並將殘留的乙醇完全移除。
5.6晾乾兩分鐘，此過程一直保持PCR管放置在磁鐵架上。
5.7將PCR管從磁鐵架上取下，加入20 μl的無核酸酶水，然後利用移液器上下輕柔吸打重懸磁珠，並在室溫孵育5分鐘。
5.8將PCR管重新放回到磁鐵架上放置約2分鐘，直到上清液無可見磁珠。
5.9將洗脫液18 µl取出放置到新PCR管中。
6.利用NanoDrop測定純化後的DNA濃度。
五、利用Cas9和gRNA體外酶切 (此步驟需使用RNase-free的試劑和耗材)
為了消除共擴增的高豐度植物序列，利用Cas9/gRNA剪切第一輪擴增純化產物中的共擴增的線粒體16S rRNA基因序列。
1.將「gRNA的合成」步驟體外轉錄合成的gRNA利用無核酸酶水稀釋至60 (ng/μl)，然後90 °C熱變性5分鐘迅速置於冰上冷卻。
2.在RNase-free 1.5 ml離心管中準備酶切體系：
Nuclease-free H2O
22 μl
NEBuffer 3.1
3 μl
1 µM Cas9 (M0386S)
2 μl (60nM final)
gRNA (denatured)
1 μl (60 ng)
Total reaction volume
28 μl
註：為了獲得最佳的剪切效率，要將Cas9和gRNA以及剪切底物DNA的摩爾比保持在10:10:1或更高比例。分子量可通過 (http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation)進行換算。如果所用通用引物能擴增線粒體和葉綠體16S rRNA基因，該反應中需兩種不同的gRNA (cp-gRNA和mt-gRNA)來去除宿主序列。
3.將準備的酶切體系室溫 (25 °C)靜置10分鐘，然後加入磁珠純化的一輪PCR產物2 μl (60 ng)，輕彈離心管混勻。
4.37 °C孵育12個小時。
5.將1 µl (0.8 U/μl) 的蛋白酶K加入到酶切反應中，並繼續在37 °C孵育10分鐘，然後65 °C水浴鍋中孵育10分鐘將蛋白酶K進行變性處理。
6.如「gRNA的合成」步驟20所述方法利用苯酚/氯仿抽提純化酶切產物，最後加入10 μl無菌雙蒸水溶解DNA，利用NanoDrop測定DNA濃度。
六、16S rRNA二輪擴增
為了加入Illumina平臺兼容的測序接頭序列，以及區分不同樣品的index序列。利用酶切純化產物為模板進行二輪擴增，PCR體系為25 μl，全長的引物序列見下表。
Primer Name
Sequence (5』>3』)
P5-index-Rd-F
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACXXXXXXTCGTCGGCAGCGTCAG
P7-index-Rd-R
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXGTCTCGTGGGCTCGGAG
註：下劃線標註的為Illumina測序儀P5/P7端流動槽結合區，xxxxxx代表是index序列，其中合成的引物需ULTRAPAGE方法進行純化。
1.設置如下PCR反應體系：
Cas9 digested DNA
10 ng
I-5 2× High-Fidelity Master Mix
12.5 μl
P5-index-Rd-F (10 μM)
1.25 μl
P7-index- Rd-R (10 μM)
1.25 μl
Add ddH2O to
25 μl
2.運行如下PCR程序：
98 °C預變性1分鐘；擴增8個循環：98 °C變性30秒, 58 °C退火10秒，72 °C延伸15秒；循環完成後72 °C放置5分鐘。
3.取5 µl的PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳，檢測擴增產物 (圖5)。
圖5. 16S rRNA二輪擴增示意圖.
靶向水稻線粒體16S rRNA基因的gRNA序列 (mt-gRNA1196)。Cas-16S-seq建庫方法 (Cas9+)和常規16S-seq建庫方法 (Cas9-)，#1-#3代表的是三個生物學重複，*代表水稻線粒體799F-1193R的擴增子序列。
4.二輪擴增產物利用上述「16S rRNA一輪擴增」步驟5磁珠純化方法進行純化。
5.利用NanoDrop進行DNA濃度的測量。
6.將純化的產物按照等摩爾比進行混樣，將混合文庫再次利用1.8倍的磁珠進行純化，然後樣品在Illumina HiSeq 2500使用2 × 250 bp進行雙端測序。
註：在整個實驗過程中應始終設置包含試劑耗材，引物的陰性對照組。
溶液配方
1.磷酸鹽緩衝溶液 (1,000 ml)
利用800 ml雙蒸水溶解8 g NaCl，0.2 g KCl，1.44 g Na2HPO4，0.24 g KH2PO4，利用HCl將pH調整到7.4，最後用雙蒸水使體積定容到999 ml，高溫高壓滅菌，待恢復到室溫後，加入1 ml的TWEEN 20並混合均勻後使用。
2.0.1‰ DEPC處理水
將DEPC按照1:10,000 (體積比) 加入雙蒸水，放置於磁力攪拌器上攪拌超過8小時後高溫高壓滅菌處理。
3.3 M醋酸鈉，pH 5.2 (100 ml)
將24.61 g的無水乙酸鈉溶解於80 ml未滅菌的DEPC處理水中，加入HCl將pH調整到5.2，最後加入未滅菌的DEPC處理水定容至100 ml，高溫高壓滅菌。
致謝
本研究由國家自然科學基金 (31622047) 和轉基因新品種培育重大專項 (2018ZX08010-05B)資助完成。
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