1、為什麼要關注基因編輯脫靶問題？
CRISPR / Cas9系統在基因組編輯中顯示出巨大的潛力，但其脫靶可能給宿主生物帶來嚴重的問題。脫靶可以導致染色體重排，在不完全匹配的基因組處造成損傷，並限制了GE在人類醫學研究上的應用。除幹擾染色體穩定性外，脫靶效應還可能導致功能基因活性的喪失，從而導致各種生理或信號異常（圖1）。在植物中，CRISPR/Cas9已在超過30種植物物種和數百個基因實現成功編輯。與人類的基因療法和臨床研究不同，植物研究不受倫理學問題的影響，並且對GE的脫靶效應的耐受性可能更高。雖然對於植物脫靶效應可以通過育種過程表型篩選來消除脫靶突變或自發突變，但對科學問題的研究依然帶來很大的不確定性。因此非常有必要對基因組編輯中存在的脫靶問題進行系統分析，為未來更加高效、精準地利用基因編輯技術提供理論依據及解決方案。圖1. CRISPR/Cas9系統的脫靶效應
2、基因編輯脫靶效應是如何產生的？
Cas9與DNA之間的相互作用首先是通過PAM位點的識別和結合來介導的，同時crRNA和潛在靶標編輯序列之間的結合進行定向反應，形成穩定的R-循環，進而激活酶切活性使PAM近端DNA斷裂。當sgRNA序列識別出特定序列之外的部分錯配而不是靶上位點時，就會產生脫靶效應（圖2）。同時，許多關於脫靶的研究指出，錯配的類型及其與PAM序列的距離非常重要。通過該信息可以開發出多種脫靶評分方法，從而有助於基於脫靶預測的gRNA選擇。圖2 CRISPR/Cas 9 系統脫靶效應產生的機制
3、CRISPR/Cas系統脫靶效應的檢測方法及應對策略有哪些？
針對CRISPR/Cas系統存在脫靶效應，已經開發出多種檢測脫靶效應的方法主要包括Whole-genome sequencing (WGS)、Genome-wide, unbiased identification of DSBs enabled by sequencing (GUIDE-seq)、Digested genome sequencing (Digenome-seq)、BLESS、EndoV-seq (Endonuclease V sequencing)等以及 CRISPR-PLANT v2、CT-Finder(CRISPR Target、Cas-OFFinder) 等多種脫靶預測工具。儘管脫靶效應可能會限制基因組編輯的廣泛使用，但基因組編輯技術的發展為包括動物，人類和植物在內的各種生物體的基因組編輯提供了一系列分子工具，為了克服脫靶問題，越來越多的新型編輯系統（單鹼基編輯系統、Cas9系列變體、截短的sgRNA、RNA編輯系統等），高質量的參考基因組信息，更加合理、高效的sgRNA設計工具，高效的GE遞送系統等得以開發，能夠使基因組編輯體系越來越精確，高效和可靠，避免或減少脫靶效應。華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室張獻龍教授和金雙俠教授為該論文的共同通訊作者，植物科學技術學院已畢業博士生Hakim Manghwar和博士生李波為共同第一作者。該研究得到國家科技部轉基因專項（2018ZX08010-05B、2016ZX08005-001-006和 2019ZX08010-003）和中國工程院諮詢項目(2018-XY-63)的支持。原文連結：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/advs.201902312
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