Science | 科學家成功開發新型檢測技術,可實時檢測基因編輯脫靶效應!

2021-01-19 測序中國

自誕生之初，CRISPR基因編輯技術一直無法克服的難題就脫靶效應。脫靶效應有可能導致基因突變，其不確定性和未知的安全風險限制了基因編輯技術的推廣應用。目前的基因編輯技術尚無法精準靶向目標序列，並不產生脫靶效應。科學家認為，既然無法完全避免，為安全起見，更好地了解、控制可能產生的脫靶效應是一個不錯的選擇。因此，脫靶檢測方法的開發成為了基因編輯領域的一個研究熱點。

近日，國際頂級學術期刊《科學》報導了一種新型基因編輯脫靶檢測方法，名為DISCOVER-Seq （Discovery of in situ Cas off-targets and verification by sequencing）。該方法可利用細胞和生物中DNA修復因子的募集特徵，準確鑑定體內基因編輯細胞的脫靶位點和Cas活性的分子表徵。該研究由加利福尼亞大學伯克利分校創新基因組研究所(IGI)、格拉德斯通研究所(Gladstone Institute)和阿斯利康(AstraZeneca)的研究團隊共同完成，文章題為「Unbiased detection of CRISPR off-targets in vivo using DISCOVER-Seq」。

雖然已經有不同的方法檢測CRISPR脫靶效應，但這些方法在實際應用中存在各種限制。例如，目前的脫靶檢測方法多使用純化的DNA或特定的細胞模型，無法實現體內直接檢測，並且存在產生假陽性結果以及殺死被檢測的細胞等問題。此外，最常用的檢測方法仍僅限於實驗室培養的細胞，不適用於患者來源的幹細胞或者動物組織。

新開發的DISCOVER-Seq方法，可通過精確追蹤體內DNA修復因子的募集，以單鹼基解析度揭示細胞中CaS活性的分子特性。經研究驗證，DISCOVER-Seq適用於多種gRNA格式和Cas酶類型，並可用於表徵新的編輯工具。此外，經研究驗證，該方法可在患者誘導多能幹細胞和小鼠細胞等任何生物系統的基因編輯過程中實時檢測脫靶效應，而不僅限於實驗室培養的細胞，為基因編輯治療期間患者體內脫靶檢測鋪平了道路。

圖1. DISCOVER-Seq工作流程

文章第一作者、IGI博士後研究員Beeke Wienert表示：「在CRISPR切割時會破壞DNA。為了生存，細胞會將許多不同的DNA修復因子募集到基因組中的特定位點，修復斷裂並將切割末端連接在一起。如果我們能夠找到這些DNA修復因子的位置，也就可以識別被CRISPR切割的位點。」

由於DNA修復蛋白可以利用ChIP-Seq鑑定化膿性鏈球菌Cas9靶點，所以該研究對不同的DNA修復蛋白進行了分析，並重點研究了MRN複合物的MRE11亞基。MRE11是第一個被募集到切割位點的修復蛋白，會緊密分布在Cas9切割位點周圍。研究發現，在基因插入和缺失出現之前，MRE11與損傷DNA的結合就會達到高峰，並且在已知gRNA脫靶時很容易被檢測到。

研究人員表示：「人類基因組非常龐大，如果列印完整的DNA序列，會得到一本16層樓高的小說。當我們用CRISPR切割DNA時，就像刪除該小說中特定頁面上的某個特定單詞一樣。DNA修復因子就像在書中添加不同類型的書籤，有的標籤是針對整個章節，但MRE11可以確切到某一個字母。」

圖2. DISCOVER-Seq可在患者衍生的誘導多能幹細胞和小鼠體內進行實時的脫靶檢測。

在基因組檢測中，DISCOVER-Seq可以利用MRE11鑑定CRISPR切割的確切位點，檢測結果更可靠。大多數MRE11 ChIP-Seq的檢測結果與預測的Cas9切割位點一致，進而能夠以單鹼基解析度鑑定核酸酶位點，揭示Cas活性的分子特徵。需要注意的是，DISCOVER-Seq檢測方法依賴於細胞的自然修復過程，侵入性更小，且適用於多種gRNA形式和Cas酶類型。

通過應用於新的細胞類型和系統，DISCOVER-Seq還能揭示CRISPR基因組編輯機制的新見解，有助於人們更好地理解CRISPR的工作原理。DISCOVER-Seq大大簡化了脫靶的檢測過程，同時提高了檢測結果的準確性。同時，該方法有助於我們更好地預測基因組編輯在臨床環境中的運作方式，改善臨床前研究，使基於CRISPR的療法更能滿足有需求的患者。

在基因編輯脫靶檢測方面，我國科學家也在不斷努力。今年3月，中國科學院等單位的研究人員成功開發了一種新型脫靶檢測技術GOTI，該技術可在不藉助於任何脫靶位點預測技術的情況下發現隨機脫靶位點，顯著提高了基因編輯脫靶檢測的敏感性。點擊連結，查看此前報導

在治癒人類罕見病、遺傳病方面，基因編輯技術被寄予厚望，但在過去的幾十年中，科學家始終難以克服脫靶效應這個難題，這也成為制約該技術成功應用於臨床的一大瓶頸。在更安全有效的基因編輯工具出現之前，精準的脫靶檢測技術或將成為基因編輯技術臨床轉化的關鍵。

參考資料：

1. Unbiased detection of CRISPR off-targets in vivo using DISCOVER-Seq

https://science.sciencemag.org/content/364/6437/286.full?_ga=2.217470229.2076339049.1556000128-1911026261.1556000128

2. DISCOVER-Seq Detects Off-Target CRISPR Effects

https://www.genengnews.com/news/discover-seq-detects-off-target-crispr-effects/

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