微生物16S+代謝組學文章喜登微生物一區頂刊Microbiome

前言

2020年8月歐易/鹿明生物合作客戶孫逸仙紀念醫院李建明團隊在Microbiome（IF：11.607）發表了題為 「EphB6基因缺陷小鼠的腸道菌群通過介導維生素B6動態平衡調節自閉症樣行為」的文章，通過16S rRNA基因測序和LC-MS非靶向代謝組學聯合分析等手段，揭示了腸腦微生物群軸對自閉症譜系障礙（ASD）的發展有重大影響，深入而透徹地闡明了腸道菌群影響小鼠腦功能缺陷的新機制。

英文標題：EphB6基因缺陷小鼠的腸道菌群通過介導維生素B6動態平衡調節自閉症樣行為

研究對象：小鼠糞便、腦組織

發表期刊：Microbiome

影響因子：11.607

單位：孫逸仙紀念醫院

發表時間：2020年8月

主要運用歐易/鹿明生物技術：16S rRNA基因測序（歐易生物提供技術服務），LC-MS非靶標代謝組（鹿明生物提供技術服務）

研究背景

自閉症譜系障礙（ASD）是一種發育障礙性疾病，目前對自閉症的核心症狀的有效治療很有限。ASD患者臨床研究證據表明，腸道菌群與ASD發展之間存在聯繫，但腸道菌群與ASD的腦功能障礙（腸腦軸）聯繫機制尚未完全闡明。

在腸道穩態起著重要作用的EphB6基因（位於7q號染色體，屬於受體酪氨酸激酶Eph家族），因基因突變和在ASD患者中表達下調，被認為是ASD的候選基因。但尚不清楚EphB6在調節腸道菌群和ASD發生的作用機制。

本研究中作者發現EphB6在功能上與ASD相關，並通過腸道菌群介導的維生素B6和多巴胺，調節患者自閉症樣行為。作者建立了EphB6基因缺陷小鼠腸道菌群失調與中央前額葉皮層（mPFC）（關鍵的腸腦功能軸）的興奮/抑制失衡之間的功能聯繫。

研究思路

實驗方法

實驗樣本

基於C57BL/6J小鼠系的健康雄性EphB6+/+（WT）和EphB6-/-（KO）小鼠模型。

2.主要實驗方法

（1）蛋白和轉錄分析：蛋白質印記分析、定量逆轉錄PCR分析；

（2）16S rRNA基因測序分析；

（3）代謝組學實驗：LC-MS非靶向代謝組學分析，胺基酸\神經遞質LC-MS靶向分析，5-磷酸吡哆醛、吡哆胺和吡哆醇靶向分析；

（4）其他：蘇木精-伊紅組織染色、腸通透性測定、小鼠行為測試、立體定向手術和藥物顯微注射、腦組織電生理學檢測；

實驗結果

1.缺失EphB6導致小鼠自閉症樣行為和腸道微生物紊亂

自閉症樣行為增加：作者發現KO小鼠比WT小鼠梳理毛髮的時間更多（圖1a），且在社交分區測試中社交互動異常。KO小鼠在嗅覺適應性/不適應性測試中對充滿社交氣味的棉籤興趣較少（圖1i），表現出交流障礙。在高架十字迷宮測試中，KO小鼠在開臂處時間更少，而在閉臂時間更長（圖1j），表明KO小鼠出現焦慮樣行為。總之EphB6的缺失導致小鼠出現自閉症樣行為，包括刻板行為和社會缺陷，以及焦慮樣行為，但沒有表現出智力障礙。

腸通透性提高：與WT小鼠相比，KO小鼠的腸通透性顯著提高（圖1k）。此外，KO小鼠結腸中緊密連接分子Cldn4的mRNA表達更低，IL-1β（促炎因子）mRNA表達大幅增加，且有抗炎作用的IL-6表達降低，而迴腸遠端、結腸、肝和肺的形態學沒有改變。

糞便微生物組成變化：Bray-Curtis距離的主坐標分析表明，KO與WT小鼠的糞便微生物群組成不同（圖1p），主要差異在KO小鼠糞便菌群中脫鐵桿菌門的黏膜螺旋藻屬豐度降低（圖1q）。

上述結果表明小鼠EphB6的缺失導致腸道通透性增加和腸道微生物組成發生變化。4周齡KO與WT小鼠的主坐標分析中，腸道菌群組成不同，但3周齡小鼠腸道菌群組成相似。同時4周齡的KO小鼠表現出刻板行為增加和對社交氣味興趣降低，進一步暗示異常行為與EphB6缺失小鼠中腸道微生物紊亂之間的可能關係。

圖1 | 缺失EphB6導致小鼠自閉症樣行為和腸道微生物紊亂

2.移植EphB6基因缺陷小鼠的糞便菌群在C57BL/6J小鼠中引起自閉症樣行為

將8周齡的雄性WT或KO小鼠糞便菌群灌胃給3周齡SPF雄性C57BL/6J小鼠（圖2a），三周後發現兩組小鼠腸道微生物組成不同（圖2b），同時發現接受KO小鼠糞便微生物群的C57BL/6J小鼠表現出刻板行為增加和社交行為減少（圖2e-i）。另外對SPF雄性C57BL/6J小鼠進行抗生素預處理後進行WT或KO小鼠糞便菌群灌胃實驗，2周後發現兩組小鼠腸道微生物組成不同，而且接受KO小鼠糞便微生物群的C57BL/6J小鼠表現出刻板行為增加和社交行為減少。總之，來自EphB6基因缺陷小鼠的糞便微生物群在C57BL/6J小鼠中引起了刻板行為的增加和社會行為的部分受損。

圖2 | 移植EphB6基因缺陷小鼠的糞便菌群在3周齡的SPF C57BL/6J小鼠引起自閉症樣行為

為驗證腸道微生物群是否在成年小鼠的自閉症樣行為中持續發揮作用，給6周大的SPF C57BL/6J雄性小鼠口服抗生素混合物1周破壞腸道菌群後，小鼠表現出社交能力障礙。作者還發現KO小鼠腸道菌群的代謝產物在C57BL/6J小鼠中誘發了部分社交缺陷（圖3j-m）。而KO小鼠中去除代謝產物的腸道菌群也會在C57BL/6J小鼠中引起部分社交缺陷。結果表明即使在成年小鼠中，腸道菌群也與自閉症樣行為相關，並且不同的腸道細菌可能參與調節不同的行為。

圖3 | 移植EphB6基因缺陷小鼠糞便菌群會誘導6周齡SPF C57BL/6J小鼠的部分社交缺陷

3.移植野生型小鼠糞便菌群改善成年EphB6基因缺陷小鼠的自閉症樣行為

16S rRNA基因測序結果表明，接受WT小鼠腸道菌群的KO小鼠糞便中脫鐵桿菌門的黏膜螺旋藻屬相對豐度增加（圖4c）。功能分析表明，接受WT小鼠腸道菌群的KO小鼠表現出社交行為增加（圖4f-i），且刻板行為有降低的趨勢（圖4e）。總之，腸道微生物紊亂是導致EphB6缺失小鼠的自閉症樣行為的原因。

圖4 | 移植野生型小鼠糞便菌群改善了成年EphB6基因缺陷小鼠的自閉症樣行為

4.腸道菌群介導的維生素B6動態平衡調節EphB6基因缺陷小鼠的社交行為

作者通過實驗探索腸道菌群影響大腦並在EphB6基因缺陷小鼠中引起自閉症樣行為的機制。有研究表明ASD與海馬體、小腦和中央前額葉皮層（mPFC）有關，KO小鼠mPFC中c-Fos蛋白表達顯著高於WT小鼠。對於某些實驗來說mPFC太小，因此後續實驗使用了PFC。

因為KO小鼠腸道菌群的代謝產物也引起了C57BL/6J小鼠的社交缺陷，作者假設某些受腸道微生物影響的物質會導致KO小鼠的社交缺陷。使用LC-MS非靶向代謝組學方法檢測了小鼠PFC中代謝物，發現兩組小鼠之間有顯著差異（圖5a），差異代謝物富集到的代謝通路包括維生素B6代謝途徑，主要因為KO小鼠中該途徑的吡哆胺（PM）和吡哆醛5'-磷酸（PLP）相對豐度降低（圖5b-d）。

人體維生素B6主要來自飲食和腸道細菌合成，然後被腸道吸收。檢測小鼠糞便、血液和PFC中維生素B6含量發現，EphB6基因缺陷小鼠糞便中吡哆醇（PN）含量升高，血漿PM和PLP含量降低，前額葉皮層PLP含量降低。（圖5e-k）。接受WT小鼠腸道微生物移植一周後，KO小鼠糞便中PN含量降低，血漿中PM含量升高，PFC中PLP含量升高。這些結果表明，腸道菌群可能通過調節腸道中維生素B6吸收來調節小鼠糞便、血液和PFC中維生素B6水平。

圖5 | 腸道菌群調節EphB6缺陷小鼠的維生素B6

作者又向KO小鼠補充維生素B6，以闡明其對自閉症樣行為的影響。腹腔注射1 mg PLP後一小時，與對照組小鼠相比，KO小鼠的血漿PLP水平較高（圖6b），社交行為增加（圖6d-f），但相同處理對C57BL/6J小鼠的社交行為沒有影響（圖6h-j）。另外使C57BL/6J小鼠缺乏維生素B6，2周後血漿PLP水平降低，小鼠社交行為降低（圖6k-n）。結果證明了腸道菌群誘導的維生素B6缺乏與EphB6基因缺陷小鼠的社會缺陷之間存在聯繫。

圖6 | 腸道菌群介導的維生素B6動態平衡調節EphB6缺陷小鼠的社交行為

5.腸微生物群介導的維生素B6動態平衡調節EphB6基因缺陷小鼠腦前額葉皮層中的多巴胺

維生素B6參與細胞多個生化反應，包括胺基酸和神經遞質生物合成和分解代謝。通過靶向代謝組學檢測方法，發現給予無菌PBS或WT小鼠糞便微生物群的WT和KO小鼠PFC中，穀氨酸、γ-氨基丁酸（GABA）、甘氨酸、天冬氨酸、絲氨酸和穀氨醯胺水平相似（圖7a/b）。與WT小鼠相比，KO小鼠PFC中多巴胺降低、5-羥色胺（5-HT）增加（圖7c）。與給予無菌PBS相比，用WT小鼠糞便菌群處理可增加KO小鼠PFC中多巴胺，但不影響5-HT。另外接受KO小鼠糞便菌群移植的SPF C57BL/6J小鼠，PFC中多巴胺水平低於接受WT小鼠糞便菌群移植的小鼠。腹腔內注射PLP可增加KO小鼠PFC中多巴胺水平（圖7d），維生素B6缺乏可降低SPF C57BL/6J小鼠PFC中的多巴胺水平（圖7e）。總之，腸道菌群介導的維生素B6動態平衡影響小鼠PFC多巴胺水平。

向KO小鼠mPFC中注射多巴胺D1受體（D1R）或多巴胺D2受體（D2R）（喹吡羅）的激動劑，發現與注射人工腦脊髓液（ACSF）相比，注射D1R的KO小鼠表現出社交行為增強（圖7g-j），但注射D2R的KO小鼠沒有。注射ACSF和D1R激動劑的C57BL/6J小鼠沒有發現社交行為的差異（圖7k-m），但D1R拮抗劑導致C57BL/6J小鼠社交行為的降低（圖7n-q）。總之，在EphB6基因缺陷小鼠中腸道菌群失調和維生素B6缺乏可通過D1R介導的途徑導致自閉症樣行為。

圖7 | 腸道菌群通過維生素B6調節多巴胺進而影響EphB6基因缺陷小鼠的社交行為

6.腸道菌群調節EphB6基因缺陷小鼠中央前額葉皮層中的E/I平衡

為研究EphB6基因缺陷小鼠腸道微生物群介導的自閉症樣行為的細胞機制，作者記錄了接受無菌PBS或WT小鼠糞便微生物群處理的WT和KO小鼠mPFC的錐體神經元的自發興奮性突觸後電流（sEPSCs）和自發抑制性突觸後電流（sIPSCs）。sEPSC幅度和頻率以及sIPSCs的幅度在各組之間沒有差異（圖8b-f），而KO小鼠中sIPSCs的頻率降低，接受WT小鼠糞便菌群移植可以改善這種情況（圖8g-k）。另外，接受KO小鼠糞便微生物處理的C57BL/6J小鼠mPFC的錐體神經元中sIPSC的頻率降低。總之，腸道菌群在EphB6基因缺陷小鼠的mPFC錐體神經元中通過多巴胺調節了E/I平衡（圖9）。

圖8 | 腸微生物群和多巴胺調節EphB6缺陷小鼠mPFC中的E/I平衡

圖9 | 腸道菌群在EphB6基因缺陷小鼠中調節社會缺陷的工作模型

相關討論

首先，本研究表明EphB6在功能上與ASD相關，從建立的轉基因小鼠模型中發現小鼠EphB6的缺失誘導了自閉症樣行為，研究還揭示了EphB6在ASD中的功能，EphB6基因缺陷小鼠可以用作ASD研究的新小鼠模型。

第二，本研究發現腸道微生物紊亂是EphB6基因缺陷小鼠自閉症樣行為所必需的。通過移植KO小鼠糞便菌群，抗生素處理的C57BL/6J小鼠也可出現部分相似行為。研究還表明，腸道菌群在治療成人患者ASD核心症狀方面可能發揮作用。敲除EphB6可能會誘導Eph家族和連接蛋白之間相互作用失調，從而導致小鼠腸道黏膜通透性增加和腸道微生物菌群紊亂。

第三．缺乏維生素B6對於EphB6基因缺陷小鼠腸道微生物群介導的自閉症樣行為至關重要。研究發現腸道菌群對維生素B6調節的新作用，並證實腸道菌群介導的維生素B6改善了EphB6基因缺陷小鼠的社會缺陷。

第四，作者建立了EphB6基因缺陷小鼠中腸道菌群與腦功能障礙（腸腦軸）連接的機制。作者發現EphB6基因缺陷小鼠中腸道微生物群通過調節維生素B6對PFC中多巴胺起調節作用。另外作者發現D1R激動劑改善了EphB6基因缺陷小鼠的社會缺陷，並改善了這些小鼠mPFC中腸道菌群調節的E/I失衡。D1R可能通過改善EphB6基因缺陷小鼠GABA能抑制來調節它們的社會行為。

總之，腸道菌群介導的維生素B6缺乏引起多巴胺水平降低，進而導致EphB6基因缺陷小鼠的E/I失衡和社交缺陷。

實驗結論

本研究揭示了腸道菌群在EphB6基因缺陷小鼠的自閉症樣行為中的關鍵作用。從機理上講，腸道微生物群介導的維生素B6缺乏通過降低EphB6基因缺陷小鼠中央前額葉皮層中的多巴胺水平和誘導E/I失衡來調節自閉症樣的社會行為。作者提出了一種新的自閉症譜系障礙（ASD）小鼠模型，證明了腸道菌群在遺傳因子誘導的自閉症中的重要作用，並為腸道-大腦-菌群軸提供了新的見解，這些發現為理解和治療ASD提供了新策略。

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看點

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文章來源於鹿明生物