南土所褚海燕組綜述微生物組學的技術和方法及其應用

DOI: https://doi.org/10.17521/cjpe.2019.0222

高貴鋒 褚海燕*

中國科學院南京土壤研究所, 南京 210008

摘  要微生物組是指一個特定環境或生態系統中全部微生物及其遺傳信息的集合, 其蘊藏著極為豐富的微生物資源。全面系統地解析微生物組的結構和功能, 將為解決人類面臨的能源、生態環境、工農業生產和人體健康等重大問題帶來新思路。然而, 微生物組學研究在很大程度上取決於其技術與方法的發展。在高通量測序技術出現以前, 微生物研究主要基於分離培養和指紋圖譜等技術, 然而, 由於這些技術存在的缺陷, 人們對於微生物的認識十分有限。自21世紀初以來, 儘管高通量測序和質譜技術的革命性突破極大地促進了人們對於微生物的認識, 微生物組學技術在微生物組研究中的應用仍面臨著諸多挑戰。此外, 目前微生物組的結構和多樣性等描述性研究已臻成熟, 微生物組學研究正處於從數量到質量、從結構到功能的關鍵轉變時期。因此, 該文首先介紹了微生物組學的基本概念及其發展簡史, 其次簡述了微生物組學研究的相關技術和方法及其發展歷程, 並進一步闡述了微生物組學的技術和方法在生態學研究中的應用及存在的主要問題, 最後從技術、理論和應用層面闡述了未來微生物組學技術和方法發展的前沿方向, 並提出了今後微生物組學研究的優先發展領域。

關鍵詞微生物組學; 高通量測序; 質譜技術; 生態學研究

高貴鋒,褚海燕 (2020). 微生物組學的技術和方法及其應用. 植物生態學報, 44, 00–00. DOI: 10.17521/cjpe.2019.0222

Techniques and methods of microbiomics and their applications

GAO Gui-Feng and CHU Hai-Yan*

Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China

Abstract

Microbiome is the combination of all microorganisms and their genetic information in a specific environment or ecosystem, which contains abundant microbial resources. A comprehensive and systematic analysis of the structure and function of microbiome will provide new ideas in solving the core issues in the fields of energy, ecological environment, industrial and agricultural production and human health. However, the study of microbiome largely depends on the development of relevant technologies and methods. Before to the advent of high-throughput sequencing technology, microbial research was mainly based on techniques such as isolation, pure-culture and fingerprint. However, due to the technical restrictions, scientists could only get limited knowledge of microorganisms. Since the begaining of 21st century, the revolutionary advances in the technology of high-throughput sequencing and mass spectrometry have greatly improved our understanding on the structure and ecological functions of environmental microbiome. However, the application of microbiomics technology in microbial research still faces many challenges. In addition, the descriptive studies focusing on the structure and diversity of microbiome have already matured, and the study of microbiomics is facing a critical transition period from quantity to quality and from structure to function. Hence, this paper will firstly introduce the basic concepts of microbiomics and a brief development history. Secondly, this paper introduces the related technologies and methods of microbiomics with their development process, and further expounds the applications and main problems of microbiomics technologies and methods in ecological study. Finally, this paper expounds the frontier direction of the development of microbiomics technology and methods from the technical, theoretical and application levels, and proposes the priority development areas of microbiome research in the future.

Key words  microbiomics; high-throughput sequencing; mass spectrometry; ecological study

Gao G F, Chu H Y (2020). Techniques and methods of microbiomics and their applications. Chinese Journal of Plant Ecology, 44, 00–00. DOI: 10.17521/cjpe.2019.0222

微生物數量龐大、種類繁多, 是地球生物化學循環過程的驅動者, 是工農業生產、醫藥衛生和環境保護等關鍵領域的核心資源, 因此微生物組研究已成為新一輪科技革命的戰略高地(朱永官等, 2017)。然而, 微生物並不是孤立存在的, 而是與其所處環境緊密聯繫, 其活性和生長在很大程度上受周圍環境的影響, 包括生物環境和非生物環境(賀紀正等, 2014)。微生物與其所處環境共同構成了複雜的微生物組, 其在支撐生態系統過程和功能中發揮著不可替代的作用。為了充分發揮微生物組在各前沿領域的關鍵作用和巨大潛力, 深入理解微生物組的結構和功能至關重要。然而, 微生物組學研究的發展強烈依賴於微生物組學的技術和方法。

在20世紀80年代以前, 微生物研究主要基於微生物的分離培養, 但絕大多數微生物無法被分離培養, 因此, 這階段人們對於微生物的認識基本停留在形態觀察、分類及生理學研究。20世紀末期, DNA指紋圖譜等分子生物學技術的興起實現了不依賴於微生物培養, 而直接在DNA水平對環境整體微生物群落進行分析, 開創了微生物分子生態學研究的新時代。然而, DNA指紋圖譜只能靶標優勢類群, 不能真實反映微生物的多樣性及物種組成。自21世紀初以來, 高通量測序和質譜等技術的突破, 使得我們可以從DNA、RNA、蛋白質和代謝物等不同水平解析微生物組, 以獲得更為全面的微生物組信息。然而, 目前各組學技術仍存在一定局限性, 比如, 現有測序技術均基於使用PCR的DNA擴增, 這將會導致有些序列可能被測了多次, 而有些量少的序列則無法被大量擴增, 同時PCR過程中可能會引入錯配鹼基, 從而造成信息的丟失。在宏代謝組分析中, 氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)只能對其中的揮發性物質實現直接分析, 而對那些難揮發的物質分析效果不佳。在理論層面上, 現代生態學經過20世紀的發展已經累積了大量成熟的理論和模型, 而這些理論大都建立在宏觀生態學的基礎上, 這些理論和模型是否也適用於微生物領域, 目前還沒有明確的結論, 仍需要更多的微生物組數據支撐。在技術應用上, 僅利用單一組學技術並不能完全揭示微生物組信息, 近年來多組學技術結合的研究策略更有利於全面解析微生物組(Deng et al., 2019)。因此, 如何解決各組學技術的缺陷, 充分發揮各組學技術的優勢, 注重多組學技術的並行應用和多學科的交叉融合, 將是未來微生物組研究的必然趨勢。不僅如此, 由於高通量測序較低的測序成本, 目前微生物組研究已積累了海量的測序數據, 微生物組研究正面臨著從數量到質量、從結構到功能研究的關鍵轉變過程。

本文將首先介紹微生物組學的基本概念及其發展簡史; 其次, 簡要闡述微生物組學技術的概念和內涵, 進一步從宏基因組、宏轉錄組、宏蛋白質組和宏代謝組四部分分別概述微生物組學的技術和方法及其發展歷程; 此外, 本文將著重闡述微生物組學相關技術和方法在生態學研究中的應用及目前存在的主要問題; 最後, 本文將從技術和理論層面簡要闡述未來微生物組學技術和方法的發展方向, 強調多組學結合與多學科交叉在微生物組學研究中的重要意義, 並進一步提出未來微生物組學研究的優先發展領域, 即微生物生物地理、土壤-植物-微生物互作和微生物組功能定向調控。

1  微生物組學的基本概念及其發展簡史

微生物與其所處環境構成了複雜的生態系統, 是地球上生物多樣性的重要組成部分。微生物組(microbiome)是指一個特定環境或生態系統中全部微生物及其遺傳信息的集合, 其內涵包括了微生物與其環境和宿主的相互作用(劉雙江等, 2017; 吳慶龍和江和龍, 2017)。微生物組蘊藏著極為豐富的微生物資源, 是工農業生產、醫藥衛生和環境保護等領域的核心資源(朱永官等, 2017)。微生物組學(microbiomics)是以微生物組為研究對象, 探究其內部群體間的相互關係、結構、功能及其與環境或宿主間相互關係的學科(劉雙江等, 2017)。

微生物學研究大致可分為三個階段。第一階段: 在20世紀70年代以前, 主要採用傳統的微生物分離培養技術獲得菌株, 並進行一系列繁冗的生理生化分析, 因此人們對於微生物的認識基本停留在形態觀察、描述、分類及生理學階段。第二階段: 從20世紀80年代開始, BIOLOG、磷脂脂肪酸法、DNA指紋圖譜、基因晶片等分子生物學技術的興起實現了不依賴於微生物培養, 而直接對環境微生物群落進行分析, 開創了微生物分子生態學研究的新時代。值得注意的是, 在DNA指紋圖譜等技術的發展過程中, 還出現了第一代測序技術, 即Sanger法(Sanger et al., 1977)。1998年, 威斯康辛大學的Hand­e­lsman等(1998)首次提出宏基因組的概念, 其研究對象為特定環境中的總DNA。宏轉錄組則興起於宏基因組之後, 它以特定環境中的全部RNA為研究對象, 探究全部基因組的轉錄水平, Leininger等(2006)首次使用454焦磷酸測序技術對複雜微生物群落進行宏轉錄組研究。第三階段: 從2005年開始, 高通量測序(第二代測序技術)和質譜技術的革命性突破以及生物信息學的快速發展極大推動了微生物組研究(Falkowski et al., 2008; Herbst et al., 2013; Zhong et al., 2017; Bahram et al., 2018; Kleiner et al., 2018)。根據Web of Science核心文集的檢索結果, 出現關鍵詞「microbiome」的文章數量正以指數型增長(圖1A)。微生物之間以及微生物與其所處環境間的相互作用極為複雜, 通過宏基因組學結合宏轉錄組學以及新一代質譜技術催生下的宏蛋白質組學和宏代謝組學, 人們可以更全面、系統地解析微生物組的結構和功能。隨著微生物組研究的發展, Egert等(2006)最早提出了「microbiomics」一詞, 基於微生物組學相關技術和方法(目前主要為宏基因組學和宏代謝組學, 相比之下, 宏轉錄組學和宏蛋白組學仍處於起步階段), 微生物組學研究開始進入了空前的發展時期(圖1B)。目前, 各個國家、地區和組織正積極推進「微生物組計劃」 (表1), 研究對象涵括人體、土壤、海洋、大氣等, 力求為解決21世紀人類面臨的農業、能源、環境、海洋和氣候等重大問題提供新的思路和途徑。

2微生物組學的技術和方法及其發展

微生物組學技術是指不依賴於微生物培養, 而利用高通量測序和質譜鑑定等技術來研究微生物組的手段, 目前已被廣泛應用於環境微生物組研究, 其研究對象包括土壤、水體、大氣和人體等。目前, 微生物組學技術主要包括以下4種:

(1)微生物宏基因組學(microbial metagenomics): 通過提取環境微生物的全部DNA, 研究其群落組成、遺傳信息及其與所處環境的協同進化關係(Turn­baugh & Gordon, 2008)。

圖1  歷年來發表的微生物組學相關文章數量趨勢圖。A,包含關鍵詞「微生物組」的文章數。B,分別包含關鍵詞「微生物」「宏代謝組學」「宏蛋白質組學」「宏基因組學」「宏轉錄組學」的文章數量。數據來源於Web of Science核心文集(時間: 1900–2019年)。

Fig. 1  Tendency of the published articles over years. A, Number of articles with the keyword 「microbiome」. B, Number of articles with the keyword 「(「microorganism*」 or 「microbe*」 or 「bacter*」 or 「archae*」 or 「fung*」)」 and 「metagenomics」, 「metatranscriptomics」, 「metaproteomics」 and 「metabolomics」, respectively. Data were collected from Web of Science Core Collection (Time: 1900–2019).

表1  全球重大「微生物組計劃」一覽

Table 1  General survey of 『Microbiome Project』 in the world

主導部門 Department

啟動時間

Starting year

計劃名稱 Project name

美國國立衛生研究院 US National institutes of Health

2007

人體微生物組計劃 The Human Microbiome Project

美國阿貢國家實驗室 Argonne National Laboratory

2010

地球微生物組計劃 Earth Microbiome Project

巴西國家科學技術研究院 Instituto Nacional de Pesquisas Espaciais

2013

巴西微生物組計劃The Brazilian Microbiome Project

美國白宮科學和技術政策辦公室與聯邦機構、私營基金管理機構
Office of Science and Technology Policy, Federal Agency, Private Fund
Management Agency

2016

國家微生物組計劃 National Microbiome Initiative

南非和美國國際開發署
South Africa and United States Agency for International Development

2016

非洲土壤微生物組計劃 African Soil Microbiology Project

中國科學院 Chinese Academy of Sciences

2017

中國微生物組計劃China Microbiome Initiative

(2)微生物宏轉錄組學(microbial metatranscriptomics): 研究環境中全部微生物的轉錄組信息, 揭示相關基因在時空尺度上的表達水平, 從而對微生物群落的相關功能進行研究(Aguiar-Pulido et al., 2016)。

(3)微生物宏蛋白質組學(microbial metaproteomics): 定性和定量地分析環境微生物在特定環境條件和特定時間下的全部蛋白質組分(Wang et al., 2016)。

(4)微生物宏代謝組學(microbial metabolomics): 對微生物在特定生理時期內所有低分子量代謝物(包括代謝中間產物、激素、信號分子和次生代謝產物等)進行定性和定量分析, 並研究其與環境之間的相互作用(Tang, 2011)。

微生物組學技術在微生物組研究中的廣泛應用主要得益於以下幾點:

(1)測序技術的突破

在20世紀80年代以前, 人們對於微生物的認識主要基於微生物的分離培養, 但絕大多數微生物不可被分離培養。為了克服這個技術缺陷, 研究人員開展了大量工作, 比如延長培養時間和優化培養條件等, 以提高微生物培養效率, 但效果仍不理想。

從20世紀80年代開始, 為了克服純培養的缺陷, 研究人員開始利用微生物細胞內的DNA來評估微生物的種類和結構多樣性, 這種在遺傳分子水平來研究微生物群落的方法即為現代分子生物學方法, 主要包括DNA指紋圖譜、基因晶片和穩定性同位素探針等(劉國華等, 2012)。值得注意的是, 在DNA指紋圖譜等技術的發展過程中, 還出現了第一代測序技術(Sanger法)。Sanger法始於1977年, 其原理是基於核酸模板在複製或轉錄時雙脫氧鹼基會終止PCR的原理, 進一步利用凝膠電泳分離長度僅差一個鹼基的核酸片段。使用該技術完成的噬菌體X174全長5375個鹼基的基因測序標誌著微生物研究進入了基因組學時代(Sanger et al., 1977)。Sanger法測序具有讀長長(1000–1500 bp)、準確度高等優點, 2001年完成的首個人類基因組圖譜也是以Sanger法為基礎, 目前該技術仍被用於獲取高準確度的測序數據。然而, Sanger法每次只能測一條單獨的序列, 導致其測序成本高, 無法大規模應用。

二代測序的原理是邊合成邊測序, 通過捕捉新合成的末端的標記來確定DNA的序列, 該技術在保持測序準確度的同時, 主要解決了Sanger法測序通量低的問題, 二代測序可同時對幾萬到幾百萬條DNA序列進行測序, 因此也被稱為高通量測序。現有平臺主要包括Illumina Hiseq、MiSeq、NovaSeq 6000等。二代測序的進步極大推動了微生物組學的發展, 2006年, Leininger等(2006)首次使用454焦磷酸測序技術對農田土壤氨氧化微生物群落進行了研究。迄今為止, 大規模的微生物組測序項目仍主要依賴於二代測序技術, 其被廣泛應用於土壤、水體和沙漠等複雜環境樣品中的土壤微生物群落分析(Bailly et al., 2007; Shi et al., 2009; Damon et al., 2012; Zhang et al., 2019)。然而, 二代測序也存在不足, 其測序片段被限制在了250–300 bp, 由於存在系統偏好性且建庫過程中使用了PCR擴增, 將會導致有些序列可能被測了多次, 有些量少的序列則無法被大量擴增, 同時PCR過程中可能會引入錯配鹼基, 從而造成信息的丟失(Shendure & Ji, 2008)。

三代測序(單分子測序)的原理是通過現代光學、高分子和納米技術等手段來區分鹼基信號的差異, 直接讀取DNA的序列信息, 從而解決了二代測序信息丟失和鹼基錯配等問題(Schadt et al., 2010)。該技術是一個新的裡程碑, 它整合了一代和二代測序的優點, 即測序過程無需PCR擴增, 且具有高通量、長讀長(10–15 kb)的特點, 但三代測序依賴於DNA聚合酶的活性, 錯誤率偏高(15%–40%), 幸運的是, 三代測序的錯誤是完全隨機發生的, 因此可通過多次重複測序來糾正, 但這將增加測序成本。目前市場上以PacBio SMRT和Oxford Nanopore技術為主, 主要應用於複雜環境樣品的基因組測序(Schloss et al., 2016)和單細胞基因組測序(Rice et al., 2016)。

(2)質譜技術的發展

微生物數量巨大、種類繁多, 儘管高通量測序技術的突破大大增加了人們對於微生物的認識, 但隨著研究的深入, 人們意識到單從基因和轉錄水平並不能完全揭示微生物的奧秘, 並逐漸意識到蛋白質和代謝產物在微生物功能研究中的重要性。對複雜環境中的微生物群落功能研究一直是生物學研究的重點和難點, 長期以來的研究大多依賴於代謝產物或底物濃度的變化, 遺漏了絕大多數微生物, 難以真實反映微生物在複雜環境中的生理代謝信息(賀紀正等, 2014), 因此微生物多樣性及其功能也常被認為是「灰箱」。

質譜技術是宏蛋白質組學和宏代謝組學的核心技術, 通常結合色譜技術對複雜樣品中的蛋白質或代謝物進行分析(White et al., 2016)。質譜分析是先將物質離子化, 然後按離子的質荷比(m/e)進行分離, 最後測量各離子譜峰的強度而實現物質定性和定量分析, 是研究、分析和鑑定生物大分子的前沿方法(王桂友等, 2009; Herbst et al., 2013; Zhong et al., 2017; Kleiner et al., 2018)。傳統的蛋白分析方法有凝集素親和層析和Western蛋白印跡分析, 但一次實驗僅能分析一到幾個蛋白, 無法滿足大規模分析的需求。20世紀70年代, 雙向電泳的出現, 使得細胞系或細胞器的大量蛋白質能展示在雙向凝膠上, 形成了狹義上的蛋白質組學概念, 該技術能對複雜蛋白質混合樣品進行定性和定量分析, 但該技術對部分低豐度蛋白、極端等電點的蛋白以及一些疏水性蛋白分離效果不佳。近年來, 隨著多重色譜分離與質譜聯用技術的發展, 分離法在蛋白質組學分析中的應用日益廣泛, 與傳統雙向凝膠電泳相比, 其分離效果要更優, 可以得到更為精確的蛋白質信息(White et al., 2016)。在過去十年間, 宏蛋白質組學由傳統的雙向凝膠電泳、蛋白質從頭測序等發展為「鳥槍法」, 可同時進行蛋白質分離、鑑定和定量。與雙向凝膠法相比, 「鳥槍法」大大增加了蛋白質的覆蓋率, 允許短時間內對上千個蛋白質進行高通量鑑定, 還可鑑定不溶性膜蛋白。

應用代謝組學對大量代謝物進行全面分析嚴重依賴於分離技術的發展。代謝組學常用的分析方法有氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)、液相色譜-質譜聯用(LC-MS)、核磁共振(NMR)和傅立葉轉換紅外光譜(FTIR)。其中, GC-MS、LC-MS和NMR是最常用的手段, 能在一次運行中檢測多種代謝物。GC-MS是一種高解析度的色譜分離方法, 廣泛用於揮發性和半揮發性有機物的分析, 適用於檢測初級代謝產物脂肪酸、碳水化合物等, 大多數基於質譜的宏代謝組學研究均使用GC-MS進行, 但GC-MS對那些難揮發的物質分析效果不佳。LC-MS則是檢測非揮發性化合物最常用的方法, 樣品無需衍生化, 可直接檢測代謝物, 比如黃酮類化合物、生物鹼等次級代謝物, 以及胺基酸、碳水化合物等初級代謝物, 是分離分析複雜有機混合物的有效手段。除了質譜技術, NMR無需大量的樣品製備和分餾工作, 可迅速檢測樣品中最豐富的代謝物, 也可以檢測出質譜難以電離的化合物, 但與質譜技術相比, 其靈敏性較差、覆蓋率低(王琳和田璐, 2019)。迄今為止, 仍沒有一種單一的分析方法能夠全面覆蓋樣品的代謝組分, 每種方法各有優劣, 因此可結合使用, 相互補充。

近年來, 從單細胞水平上分析微生物的生理代謝的單細胞技術迅速發展, 其中單細胞成像技術可將檢測結果可視化, 能較好反映環境微生物類群、豐度及其功能活性(Musat et al., 2012)。將超高解析度顯微成像技術和同位素示蹤技術相結合的納米二次離子質譜(Nano-SIMS)在微生物生態學研究領域中顯現出了巨大潛力, 該技術具有較高的靈敏度和準確度, 使得研究者不僅能夠檢測環境中低豐度但發揮重要作用的微生物類群, 還能從單細胞水平上提供微生物的生理生態特徵, 這對於認識複雜環境中微生物介導的功能至關重要。目前, Nano-SIMS技術在環境微生物研究中主要應用於碳氮硫元素生物地球化學循環的微生物驅動機制研究(Tourna et al., 2011; Huang et al., 2019)和土壤、微生物和植物互作關係研究(Gorka et al., 2019)。

(3)生物信息學的發展

生物信息學是伴隨著人類基因組計劃發展而來的學科, 包含了生物信息的獲取、加工、存儲、分配、分析、解釋等在內的所有方面, 它綜合運用數學、計算機科學和生物學的各種工具來闡明和理解大量數據所包含的生物學意義(趙屹等, 2012)。微生物組學研究依賴於生物信息學的發展, 使得後者成為微生物組學技術應用的一個主要的技術瓶頸, 可以說, 面對海量的數據, 沒有生物信息學的參與, 研究工作將寸步難行(楊雲鋒, 2013)。而伴隨著大規模測序的發展及數據積累程度的增加, 其重要性和難度也將隨之增大(賀紀正等, 2014)。

在發展過程中, 各微生物組學技術都已初步建立了各自的資料庫、算法和軟體(Breitwieser et al., 2019)。以擴增子測序為例, QIIME、Mothur和QIIME2是最常用的分析平臺。2009年, 美國密西根大學的Patrick D. Schloss教授團隊發布了首個擴增子分析流程Mothur, 它整合了之前發表的操作分類單元(operational taxonomic units, OTU)定義軟體DOTUR、OTU差異比較工具SONS等, 從而實現了第一套較完整的分析流程(劉永鑫等, 2019)。2010年, 現美國加州大學聖地牙哥分校的Rob Knight團隊發布了QIIME分析流程。QIIME的優勢主要在於它整合了200多款相關軟體和包, 使用者可以有更多軟體和方法選擇, 提供了150多個腳本, 可實現多種個性化分析, 增強統計和可視化, 實現多樣性、物種組成、差異比較和網絡等方法和出版級圖表繪製, 因此QIIME大受研究者的青睞(劉永鑫等, 2019)。為了滿足日益增長的測序數據和可重複分析的要求, Gregory J. Caporaso教授於2016年發起了基於Python 3從頭編寫的QIIME2, 該平臺實現了分析流程的可追溯, 同時整合了一系列新算法, 如物種分類新方法2-feature-classifier和序列質量控制DADA2等, 極大提高了分析流程的適用範圍和易用性。近年來, 也不斷湧現出一些在線的數據分析平臺, 如SILVAngs、MicrobiomeAnalyst、Qiita、MetaPhlAn2和gcMeta等。不僅如此, 相比擴增子測序, 宏基因組測序成本相對較高, 為此, 研究人員開發了一些可基於擴增子序列進行微生物組功能和表型預測軟體, 如PICRUSt、FAPROTAX和BugBase等。可以說, 高通量測序的進步推動了生物信息學的發展, 反之, 生物信息學的發展使得海量測序數據的序列比對、分析、拼接、功能注釋、統計學檢驗和可視化等各種分析成為可能。

3 微生物組學技術在生態學研究中的應用及存在問題3.1 微生物組學技術在生態學研究中的應用3.1.1微生物組學技術在微生物群落研究中的應用

微生物組學技術被廣泛應用於揭示複雜環境中的微生物群落(包括多樣性和群落組成)及其與周圍環境或宿主之間的關係, 其研究對象涵蓋土壤(Te­der­soo et al., 2014; Thompson et al., 2017)、海洋(Sogin et al., 2006; Moran, 2015)和冰川(Rime et al., 2015; Anesio et al., 2017)等, 主要包括以下內容:

(1)微生物生物地理。生物地理學是研究生物多樣性時空分布的科學, 長期以來, 對生物地理分布特徵的研究一直是生態學研究的重點, 包括多樣性產生和維持機制(Martiny et al., 2006)。之前普遍認為微生物的分布不同於動植物, 不具有明顯的地帶性和區域分布特徵, 而是呈全球性隨機分布(O』 Malley, 2007)。事實上, 通過構建距離-衰減關係和物種面積曲線, 發現微生物物種並非隨機分布(Horner- Devine et al., 2004b), 不同生境類型的微生物群落存在顯著差異。因此, 明確微生物的分布規律, 對生態學和生物地理學的發展以及微生物資源的充分保護和利用具有重要意義。目前, 生物地理學家和生態學家將影響微生物物種豐富度格局的因素定義為兩大類(即歷史因素和當代環境因子), 通常這兩類因子之間是相互影響的, 並與時間和空間尺度密切相關。以土壤為例, 通過整合全球189個樣地的土壤宏基因組數據, Bahram等(2018)發現, 土壤細菌的物種和功能多樣性在溫帶地區最高, 環境因子對微生物基因組成的影響大於地理距離。研究表明, 影響土壤微生物群落的環境因子主要包括土壤理化性質(Tripathi et al., 2018; Lupatini et al., 2019; Zhang et al., 2019)、植物生產力和系統發育(Yang et al., 2017, 2019)及氣候條件(Zhang et al., 2016; Guo et al., 2018)等。

(2)微生物對全球變化的響應。微生物對環境變化的響應較為敏感, 是全球氣候變化的調節器, 因此, 研究微生物組對於環境變化的響應及反饋具有重要意義, 其結果可為預測全球變化背景下生態系統結構和功能的演變提供理論依據。利用微生物組學技術, 可探究土壤微生物群落對全球氣候變化(Guo et al., 2018; Raut et al., 2018)，土地利用方式改變(Li et al., 2019; Moreno et al., 2019)和農業管理措施轉變(Xiang et al., 2017; Feng et al., 2018)等的響應。例如, 研究發現從亞馬孫雨林到牛牧場的土地利用方式的轉變對微生物多樣性具有顯著影響, 土壤細菌的局部分類和系統發育多樣性在轉化後增加, 但群落在空間上變得更加相似, 這種均質化是由有限範圍的森林土壤細菌的喪失引起的, 並導致了多樣性的淨喪失(Rodrigues et al., 2013)。其次, 通過分析當前細菌分布與歷史氣候之間的聯繫, Ladau等(2018)的研究預測了未來在區域和大陸尺度上土壤微生物的分布, 如果細菌群落與現有氣候條件相平衡, 則青藏高原和北美大部分地區(約75%)土壤中的細菌多樣性將增加。

3.1.2微生物組學技術在微生物功能研究中的應用

微生物參與了所有已知的生物地球化學循環過程, 其與植物生長、汙染物降解和其他生態系統功能密切相關(Falkowski et al., 2008), 利用微生物組學技術, 已開展了以下研究:

(1)微生物生物地球化學循環。採用微生物宏轉錄組學可以探究微生物的相關功能, 發現大量的微生物資源及新的基因, 為探索微生物群落的生態功能奠定基礎, 有助於生態系統功能和服務的調控(Gilbert et al., 2009)。例如, Poretsky等(2009)利用宏轉錄組學分析成功地從淡水和海洋浮遊細菌中獲得編碼碳氮循環中重要功能蛋白的信使RNA。此外, Damon等(2012)通過對歐洲山毛櫸(Fagus sylvatica)和挪威雲杉(Picea abies L.)林下的土壤進行宏轉錄組學分析, 發現了129條代謝通路, 包括氮循環、糖代謝、磷酸鹽代謝和有機質降解等。不僅如此, 宏蛋白質組學也被用於測定微生物群落的碳源及同化途徑(Kleiner et al., 2018)以及鑑定環境中參與元素生物地球化學循環及有機物氧化的潛力蛋白質(Bastida et al., 2014)。

(2)微生物與植物生長和健康。宏基因組學和宏代謝組學也被廣泛用於探究微生物與宿主、環境之間的相互關係, 進而了解生物間相互作用的機制(Han et al., 2010; Wagner et al., 2016; Yang et al., 2017; Čapek et al., 2018)。例如, Shi等(2019a)通過擴增子高通量測序, 研究發現發病輕的薯表土病原菌和細菌豐度較低、細菌多樣性較高, 且菌群共存網絡較複雜, 為進一步解析微生物群落功能與瘡痂病發生的聯繫, 研究人員進一步對薯表土進行了宏基因組測序, 結果表明參與ABC transporters、bacterial secretion system、quorum sensing、nitrogen metabolism和一些cytochrome P450相關代謝途徑的基因顯著富集在發病重薯表土中, 而一些抗生素合成相關代謝途徑顯著富集在發病輕薯表土中, 該研究首次系統研究了土壤微生物組成和功能與瘡痂病的關係, 對揭示瘡痂病的發生機制和防治瘡痂病具有重要意義。此外, 也有研究通過宏代謝組學分析, 發現叢枝菌根真菌的定殖改變了澤菊的多種根際化合物組分(如吡咯啶生物鹼), 從而起到關鍵的生物防禦作用(Hill et al., 2018)。

(3)環境汙染微生物修復。微生物組學技術在環境汙染治理方面也表現出了巨大潛力, 包括有機汙染物降解、重金屬轉化和生物汙染等領域。例如, 微生物組學技術可用於研究環境中多環芳烴(PAHs)的微生物降解機制。首先, 可以先通過對受到PAHs汙染的土壤進行宏基因組學研究, 鑑定能降解PAHs的微生物及其關鍵基因(Gutierrez et al., 2015)。其次, 通過比較宏蛋白質組學和宏代謝組學來挖掘相關蛋白和代謝物, 並對其進行鑑定和功能分析, 從而解析微生物降解PAHs的代謝通路和內在機理(Herbst et al., 2013; Zhong et al., 2017)。

3.2 微生物組學技術在生態學研究中存在的主要問題3.2.1 樣本製備

從複雜環境中獲得高保真性和高質量的樣本是開展微生物組學研究的第一步。然而, 樣品獲取方法上的偏差仍是阻礙微生物組學研究的巨大挑戰(Nesme et al., 2016)。環境微生物組學研究最常見的樣本類型就是土壤, 其種類繁多、組分複雜、存在大量的抑制劑, 此時就需要根據不同樣品的來源及特徵採取不同的提取方法, 以獲得高多樣性和高質量的環境基因組(Jones et al., 2015; Poussin et al., 2018)。例如, 對於腐殖酸含量特別高的樣品, 可以在DNA提取過程中增加使用異硫氰酸胍(Guanidine thiocyanate)洗滌矽珠的步驟(Antony-Babu et al., 2013)。針對低豐度的微生物、蛋白或代謝物等, 目前仍缺乏有效的富集和純化技術, 這也是微生物組學研究面臨的又一重大挑戰。在蛋白質提取過程中, 直接對樣品進行原位裂解可以獲得較為完整的蛋白, 包括細胞蛋白和胞外蛋白, 但該方法會造成分類學上的困難, 同時由於土壤幹擾物的存在, 該方法用於提取土壤蛋白還有較大技術難度(於仁濤等, 2009)。2007年, 研究人員報導了一種從土壤中進行蛋白分離的方法, 先使用0.1 mol·L–1 NaOH溶液從土壤中提取蛋白質、微生物和腐殖酸等, 然後進一步經過酚提取, 將蛋白質分離(Benndorf et al., 2007)。此外, 在樣本分析前, 對獲得的樣本進行質量評估以確保達到分析要求尤為重要, 然而, 目前還沒有統一的樣本評估標準。

3.2.2樣本檢測

基於標記基因的擴增子是大部分微生物組研究的基礎, 但其樣本檢測步驟較多, 高通量測序讀長較短、存在系統偏好性等問題, 且建庫過程中使用了PCR擴增, 會導致某些序列可能被測了多次, 而有些量少的序列則無法被大量擴增, 不僅如此, PCR過程中可能會引入錯配鹼基, 從而造成信息的丟失。針對這些不足, 研究人員比較了不同文庫製備方法, 利用標準樣品詳細分析擴增過程, 揭示了PCR擴增中造成錯誤和偏差的來源, 並提出了條件優化後的基於兩步法的PCR擴增, 改進後的新方法能檢測到更多現有方法中經常無法檢測的類群, 同時提高微生物組研究的準確性(Gohl et al., 2016)。近年來, 三代測序(單分子測序)整合了一代和二代測序的優點, 測序過程無需進行PCR擴增, 從而解決了二代測序信息丟失和鹼基錯配等問題(Schadt et al., 2010), 在微生物組研究中顯現出了巨大潛力, 但其錯誤率較高。儘管高通量測序在鑑定物種及豐度上很有用, 但它並不適合於準確地確定群落中物種的絕對豐度。近年來, 通過向樣品中加入合成的嵌合體DNA作為內參, 可定量計算環境樣品中微生物的絕對豐度。但利用該方法, 研究人員發現18S和ITS擴增子可能分別高估和低估了土壤中的黴菌數量(Tkacz et al., 2018)。因此, 實驗前最好通過預實驗來選擇內參的加入量。

3.2.3 數據分析

參考資料庫的發展是限制微生物組數據分析的重要因素。據估計, 因缺乏參考基因組數據, 測序所得的宏基因組序列, 有7%–60%無法被準確分類(Vilanova & Porcar, 2016; Thompson et al., 2017)。同樣, 蛋白質的鑑定在很大程度上也取決於資料庫, 其可信度受到資料庫中存在的物種的限制(Wang et al., 2016)。目前各資料庫管理標準不統一, 仍缺乏跨領域的數據整合(馬俊才等, 2017)。

在數據處理上, 高通量測序數據的質量控制不是單一指標或操作即可完成的, 但目前還未建立統一、規範化的數據質量控制標準。目前比較成熟的序列拼接均基於一個或少數幾個基因組為前提, 在面對海量數據和複雜的基因組時, 現有算法基本都無法滿足需求。在微生物組學研究中, 大部分擴增子研究主要利用UCLUST或UPARSE等算法對97%相似性的序列進行OTU聚類, 然而不同的OTU聚類方法將對微生物組數據產生較大影響(Horner- Devine et al., 2004a)。近年來, 也出現了一些新的算法, 如DADA2和unoise3, 相當於基於100%的序列相似度進行聚類, 該方法大大提高了準確度和物種多樣性。此外, 被廣泛應用的OTU分類只能注釋到屬水平, 極少能鑑定到種水平, 這使得在某些特定微生物的功能研究上略顯乏力, 因為較粗略的物種劃分標準會導致可觀測到的微生物空間分布格局減弱甚至消失(Horner-Devine et al., 2004a)。對於宏代謝組學來說, 其數據具有高維、小樣本、高噪聲、相互作用關係複雜和冗餘性等特徵, 如何從複雜的宏代謝組學數據中提取出有價值的信息, 篩選出潛在的生物標誌物成為近年來研究的熱點和難點。

4 研究展望4.1 開發、整合新技術新方法, 建設微生物組學大數據平臺

微生物組學研究在很大程度上取決於微生物組學的技術和方法水平的高低, 隨著微生物組學的發展, 新算法和計算平臺層出不窮。然而, 不同組學技術各有優劣, 因此, 除了要發展新技術和新方法以應對不斷產生的微生物數據, 更要注重各方法間的整合和互補, 在技術和方法的選擇上應結合研究目的, 在條件允許的情況下, 對不同方法進行比較, 提高準確度和互補性。例如, 單細胞技術是21世紀最重要的新技術之一, 土壤中有90%以上的微生物功能尚未可知, 單細胞技術將能有效突破這一瓶頸, 為系統評價土壤微生物資源和定向挖掘微生物功能提供關鍵技術支撐。在數據分析方面, 微生物組學研究涉及海量數據的獲取、統計分析和建模等, 因此, 生物信息學的發展顯得尤為重要。只有進一步提升分析技術, 開發相適應的算法和軟體, 將分析技術、數據處理、多元統計分析及可視化有機結合起來, 才能更好地推動微生物組學研究。

Xu等(2017)指出, 在未來十年, 微生物組學數據分析將轉變為微生物組數據科學。微生物組學大數據的收集、存儲、功能挖掘和開發利用是制約微生物組學發展的核心問題(馬俊才等, 2017)。在數據收集上, 應制定並執行標準化分析流程, 確保數據具有再現性、穩健性、可複製性和普遍性(Poussin et al., 2018; Schloss, 2018)。在數據分析過程中, 要進一步豐富相關參考資料庫, 目前, 地球微生物組計劃已經呼籲並鼓勵世界各地的科學家按照協議共享數據(Gilbert et al., 2018; Langille et al., 2018)。近年來, 隨著測序成本的降低, 微生物組學數據急劇增加, 但絕大多數數據都是一次性利用, 因此, 如何充分挖掘、利用現有的海量測序數據是微生物組學研究面臨的另一個重要挑戰。在微生物組學研究發展過程中, 應大力支持微生物組數據科學的發展, 進行有效的經費支持、制定有效的數據標準和實現互通, 建立對數據進行比較分析、整合併實現數據標準化的微生物組數據中心(Becher et al., 2013; Kyrpides et al., 2016)。目前, 我國也開發了部分微生物組學大數據平臺, 如gcMeta, 其建立了一個微生物宏基因組和宏轉錄組的管理、在線分析、可視化及數據發布的一站式系統, 目前已整合了來自國際相關平臺(NCBI、EBI等)重要項目(HMP、Tara等)超過12萬個樣本數據(Shi et al., 2019b)。未來還可進一步整合其他組學數據, 包括宏蛋白組學、宏代謝組學和單細胞測序等數據, 從而能更全面、系統地解析微生物組, 為我國微生物組學研究發展奠定堅實的基礎。

4.2 多學科交叉與多組學結合

微生物組學的發展需要多學科交叉, 這種交叉是新技術、新方法的活水之源。微生物組學的信息分析最終目標是要闡明微生物群落組成、功能、結構，以及群落與環境的相互作用, 所以如何有效地利用和挖掘微生物組學數據來建立分子生態的理論, 是微生物組信息分析過程中的重中之重。在這點上, 微生物組學研究需要與生態學相結合, 可以先借鑑宏觀生態學已經建立起來的生態理論和模型, 運用於微觀的微生物群落上, 然後通過改進這些理論和模型來理解和改造微生物群落, 從而為環境變化的預測提供依據。此外, 微生物不能獨立於周圍環境而存在, 因此, 微生物學和土壤物理、土壤化學等學科的交叉, 將更有利於系統解析微生物組結構、功能及其環境影響機制, 其所呈現出的系統生物學研究模式, 將有望成為未來生命科學領域令人激動的新前沿。

微生物組學的發展也離不開多組學結合的研究策略, 包括微生物分離培養、生態學鑑定和代謝產物分析等。儘管每種組學方法都對微生物組學研究提供了有價值的信息, 但僅僅基於DNA測序的方法分析微生物群落的多樣性和群落組成, 並不能很好地研究微生物組的功能特徵(Emerson et al., 2017)。倘若將多組學結合起來, 一方面可描繪出更為全面的微生物組信息(Aguiar-Pulido et al., 2016; Jansson & Baker, 2016), 另一方面也能豐富現有資料庫(Wang et al., 2016)。因此, 多組學結合是未來微生物組學研究發展的必然趨勢, 現階段的研究除了要簡化複雜的多組學數據, 還應注重微生物培養組學的發展和應用, 以便更好地解析微生物群落結構及其功能(Bashiardes et al., 2016; Vilanova & Porcar, 2016)。

4.3 建議優先研究領域4.3.1 微生物生物地理

我國幅員遼闊, 生境複雜多樣, 不同地區氣候、植被和土壤類型差異較大, 且受人類活動幹擾程度不同, 藉助微生物組學技術研究微生物的時空分布有助於深入挖掘土壤中的未知生物資源(包括細菌、古菌、真核生物和病毒等)和微生物組的代謝產物(如胺基酸、抗生素和激素等), 深刻理解土壤中微生物多樣性的產生和維持機制, 闡明影響微生物群落的主要環境因子。目前, 大多數微生物生物地理學研究在不同空間尺度上進行, 但在較大時間尺度上的研究仍較少, 已有研究表明微生物和動植物一樣, 都具有晝夜節律和季節變化規律, 因此, 未來微生物組在較大時空尺度下的動態變化值得關注, 特別是在一些特殊生境, 如氣候變化敏感區、乾旱半乾旱區和海陸交錯帶等。此外, 不局限於單個營養級, 也可從食物網角度, 解析微生物地理分布格局及其與驅動因子、植物區系等直接的關係。在此基礎上, 研究環境微生物組對全球變化的響應, 包括全球氣候變化、農業管理措施和土地利用方式改變等, 並可進一步預測全球變化背景下微生物群落及其功能的演變方向。以往研究大多僅關注某一個全球變化驅動因子, 缺乏微生物組對多個環境因子綜合作用的響應研究, 未來這方面的工作將對評估全球變化背景下微生物組的演變提供重要依據。

4.3.2 土壤-植物-微生物互作

在自然界中, 正常生長的植物(包括地上和地下部分)表面和內部都富集了數量龐大且種類繁多的微生物, 這些微生物為植物微生物組(Müller et al., 2016)。這些微生物編碼了比宿主植物更多的基因, 通過協作和競爭形成穩定的群落結構, 對植物生長發育、抗病、抗逆等至關重要。然而, 目前對這些微生物的認識還比較片面, 大多數研究主要集中在豆科植物-根瘤菌、共生菌根真菌、某些病原菌和非共生植物根際促生菌上, 這些微生物僅是植物微生物組中比例很小的一部分。人們對於絕大部分植物微生物組還並不了解, 因此未來在繼續開展這方面功能微生物組研究的基礎上, 還應擴展到植物整體微生物組, 以更全面系統解析地植物微生物組的結構和功能。此外, 由於技術的限制, 傳統的研究主要依賴於在實驗室條件下開展植物與單一微生物的互作關係研究, 很少在自然狀態下研究微生物組與宿主植物共存的機制, 因此, 未來應注重從植物整體微生物組層面上, 對土壤-植物-微生物系統的營養物質，生長調節化合物，信號分子(酚類化合物、黃酮類化合物、獨腳金內酯等)的生物合成、生物活性及調控機制等物質流和信息流進行深入分析, 深刻理解生物互作過程中的分子生物學和生物化學基礎, 從而為微生物合成生物學的進一步開展提供重要的科學依據。

4.3.3 微生物組功能調控

微生物作為地球上生命的先驅, 與人類生產、生活和生存息息相關。目前, 人類正面臨著糧食安全、環境汙染、全球氣候變化和能源等多方面威脅, 基於微生物組結構和功能對生物圈的廣泛影響, 深入理解、發掘並利用微生物組資源, 定向調控微生物組的生態調控作用和功能, 將為解決以上問題提供革命性的新思路和新方法。基於微生物組工程的常規原則和最佳方法, 研究人員提出了一種重複的設計-構建-檢測-學習(DBTL)循環, 以推進微生物組工程研究和技術發展(Lawson et al., 2019)。在農業生產上, 結合作物根際微生物組和葉片微生物組等, 研究微生物組對作物抗病、抗逆、產量、品質等的調控機制, 研究微生物組對作物連作障礙的影響和克服手段。在此基礎上, 廣泛篩選促進農作物生長的微生物, 開發微生物肥料和菌劑, 了解其作用機理, 研究其對土壤肥力保持、植物抗病、克服連作障礙和提高作物品質等方面的作用。此外, 進一步構建作物的簡易微生物組, 以增強抗逆、增加固氮, 減輕現代農業對化肥、農藥和除草劑等的嚴重依賴, 同時大幅度提高作物的產量和品質, 促進農業可持續發展。在汙染治理上, 隨著現代工農業的飛速發展, 一些難降解的新興汙染物不斷出現, 如抗生素、內分泌幹擾物和阻燃劑等。儘管微生物具有強大的環境修復能力, 但其進化速度遠不及新興汙染物出現的速度, 因此亟需應用合成生物學來解決這一難題。通過研究微生物的代謝通路, 不斷挖掘微生物代謝通路中與代謝產物相關的重要元件, 包括降解元件、轉運元件、趨化元件和抗逆元件等。在此基礎上, 運用合成生物學手段, 定向設計和改造現有降解菌株, 一方面有選擇性地開發和利用這些生物元件, 構建具備全新代謝網絡的工程菌, 使其能夠降解一種或多種汙染物; 另一方面提高現有降解菌株的降解效率, 增強菌株的環境適應性, 使其能夠在高鹽、酸鹼和高滲透壓等極端條件下保持降解活性, 為環境汙染的微生物修復提供技術支持。展望未來, 微生物組學技術將繼續在環境生態領域發揮巨大作用, 相關研究成果將為解決農業可持續發展、環境汙染修復、應對氣候變化等關鍵問題提供嶄新思路。

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特邀編委: 溫學發  編輯: 趙 航

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