2020年8月歐易/鹿明生物合作客戶中國農業科學院及青島農業大學等實驗團隊在Microbiome發表的題為 「Microbiota from alginate oligosaccharidedosed mice successfully mitigated small intestinal mucositis 」的研究成果，通過LC-MS非靶向代謝組、16s微生物多樣性、轉錄組等多種檢測手段發現了海藻酸鈉寡糖（AOS）通過增強細胞連接、恢復小腸功能以及改善可能有助於基因表達的轉錄因子來改善busulfan幹擾的腸細胞膜；AOS改善血液代謝，以支持小腸功能的恢復。
中文標題：藻酸鹽寡糖化小鼠的微生物群成功減輕了小腸黏膜炎
研究對象：小鼠
發表期刊：Microbiome
影響因子：11.607
發表時間：2020年8月
合作單位：中國農業科學院與青島農業大學
運用歐易/鹿明生物技術：LC-MS非靶向代謝組學（由鹿明生物提供技術支持）、轉錄組、16S微生物多樣性檢測等；
腸道黏膜炎症是用抗癌藥物如白消安（busulfan）、5-氟尿嘧啶或FOLFOX化療的副作用。由於胃腸道（GI）起著至關重要的作用，如：保護機體免受病原微生物的侵害，營養物質的消化/吸收、粘液和激素分泌等。
儘管已經提出了許多方法，如應用益生元、益生菌、硒、揮髮油等來減少化療引起的腸道黏膜炎，但進展甚微。海藻酸鈉寡糖（AOS）是從海藻酸鈉降解中得到的天然產物，含有聚甘露糖醛酸、聚古羅糖醛酸和雜合褐藻寡糖3種成分，被認為有抗氧化、抗炎症、抗細胞凋亡及增殖的作用。AOS通過增強細胞連接、恢復小腸功能以及改善可能有助於基因表達的轉錄因子來改善busulfan幹擾的腸細胞膜；AOS改善血液代謝，以支持小腸功能的恢復。隨後還發現，AOS可能通過增加「有益」腸道微生物和減少「有害」腸道微生物而有益於腸道微生物群。
據報導，腸道微生物群影響我們健康的許多方面，因為它提供營養和維生素，對抗病原體，維持上皮黏膜的內穩態，並支持人體免疫系統。它也被應用於許多疾病模型和臨床試驗中，治癒率非常高，副作用很少。FMT（糞便移植）已經被證明可以有效地控制腸道微生物群，改善化療引起的黏膜炎。
1.AOS有益於腸道菌群
研究發現AOS減輕了抗癌藥物busulfan誘導的小腸細胞膜的損傷，特別是細胞連接和微絨毛；同時，AOS支持血液代謝來幫助小腸恢復。這是因為腸道微生物群可以代謝營養物質，也可以調節腸道代謝物來影響血液代謝組分。
在本研究中，作者探討了busulfan和/或AOS治療後腸道菌群的變化，分為3組：（1）A0（ddH2O）；（2）BA0（busulfan+ddH2O）；（3） BA10（busulfan+AOS）。通過PCoA分析（PCoA；圖1a）可以清楚地區分三種處理之間細菌組成的差異。在屬水平上，BA10組中的乳酸桿菌的比例顯著增加。LEfSe分析評估了這些處理之間不同菌屬的差異，擬桿菌科在BA10中富集，表明AOS可以增加「有益」腸道微生物群（圖1c，d）。
另一項研究表明，經過5周的AOS給藥期後，AOS增加了「有益菌」，如擬桿菌、乳酸桿菌，而減少了「有害菌」如脫硫弧菌科。血液代謝物和腸道菌群之間有很好的相關性（圖1e），將微生物分為兩大類，代謝物分為三大類。結果表明AOS治療有利於腸道菌群進而改善小腸功能。
圖1 | AOS給藥後小腸腸道菌群變化及菌群與代謝物的相關性分析
（a）不同處理條件下腸道菌群的PLS-DA分析；
（b）在門級水平上的菌群豐度差異；
（c和d）LEfSe和LDA分析；
（e）LEfSe和LDA分析；
2. A10-FMT/A100-FMT對小腸功能的改善更為顯著
AOS有益於腸道微生物群進而改善busulfan引起的小腸功能損傷，該研究探討了FMT對小腸功能的有益改善作用。分別從AOS（10 mg/kg或100 mg/kg）或ddH2O處理組中收集腸道微生物群（圖2a）。同時，A10-FMT和A100-FMT通過增加Vil1的蛋白表達水平來恢復小腸功能（圖2b）。
為探討A10FMT/A100-FMT改善小腸功能的機制，採用RNA-seq分析對小鼠小腸進行基因表達譜分析。與Sa相比，Con-FMT中166個基因下調表達，308個基因上調表達；A10-FMT中179個基因下調表達，540個基因上調表達；A100-FMT中267個基因下調表達，572個基因上調表達（圖2c）。這些差異表達基因的KEGG信號通路分析結果表明：在這三個比較（Sa vs Con FMT；Sa vs A10-FMT；Sa vs 與A100-FMT）中，最顯著富集的信號通路是NOD-like receptor signaling pathway、antigen processing and presentation、cell adhesion molecules (CAMs)，提示FMT可能有利於小鼠腸道的免疫功能（圖2d-f）。
（a）糞便移植的實驗設計流程圖；
（b）免疫螢光檢測結果；
（c）不同比較組中的差異表達基因聚類結果；
（d-f）差異表達基因的pathway富集分析結果；
此外，多重富集分析（Metascape）結果表明，常見功能群與細胞防禦有關（圖3a，b），最特異的功能在Sa vs A10-FMT顯著富集，包括能夠幫助小腸功能恢復的細胞粘附分子、消化和吸收（圖3a）。結果表明，A10-FMT對小腸功能的改善最為有利，即AOS 10mg/kg是改善小腸的最佳濃度。由於「CAM」在RNA-seq數據中富集，因此在小腸樣本中測定了重要的細胞粘附分子的蛋白表達水平。重要細胞連接分子ZO1、Cx37、連環蛋白、E-cad（E-cadherin）和claudin的蛋白水平在Sa組最低，在Con-FMT中較高，在A10-FMT和A100-FMT中最高（圖3c）。轉錄因子SOX4、GATA4和KLF7的蛋白質水平在Sa中最低，而在A100-FMT中最高（圖3e）。同時，p-PTEN和Bcl-xl的蛋白水平表明，Sa和Con-FMT的凋亡水平較高，而A10-FMT和A100-FMT的凋亡水平較低（圖3f）。結果表明：A10-FMT和A100-FMT比Con-FMT更有益於busulfan受損的小腸。
（a）多重富集分析結果；
（b）Circos plots展示不同比較組之間的關聯；
（c-f）細胞黏連蛋白的免疫螢光及WB結果；
3. A10-FMT/A100-FMT對腸道菌群的益處更大
通過16S rDNA來分析FMT通過腸道菌群改善小腸功能的作用。A10FMT和A100-FMT組的「有益菌」擬桿菌水平較高，而Sa和Con FMT組中「有害菌」厚壁菌的水平升高（圖4b）；「有害菌」Akkermancia只存在於Sa組。此外，A10-FMT和A100-FMT的擬桿菌/厚壁菌比率高於Sa或Con- FMT（圖4c），這表明A10-FMT和A100-FMT對腸道微生物群的益處比Con-FMT更大。LEfSe分析進一步探討四組之間菌群差異（圖4d，e），Leuconostocaceae在A100-FMT中富集，表明A100-FMT增加了有益菌。FMT研究中的A10-FMT/Sa和AOS直接處理研究中的BA10/BA0的比率在「門」水平上顯示出相似的趨勢（圖4f），這表明這兩個研究中的微生物有很好的相關性。
（a）不同處理組中腸道菌群的PLS-DA分析；
（b）門水平上的菌群豐度差異；
（c） Bacteriodetes to Firmicutes比率在不同比較組中的分布統計；
（d-e）LDA和LEfSe分析；
（f）在門水平上不同菌群的不同組中的比率統計以分析其表達相關性；
4. A10-FMT/A100-FMT比Con-FMT更能恢復血液代謝
腸道微生物群在營養物質的消化和吸收中起著至關重要的作用，從而影響血液代謝，因此利用LC-MS非靶向代謝組學研究FMT對血液代謝的影響，並分析了血液代謝物與腸道菌群之間的相關性。Con-FMT、A10-FMT和A100-FMT顯著改變血液代謝物，在Sa vs Con-FMT、Sa vs A10-FMT和Sa vs A100-FMT中，分別有131、132和129種代謝物發生顯著變化（圖5a-c）。值得注意的是，Sa vs A10-FMT和Sa vs A100-FMT的53個常見代謝物具有相似的趨勢（圖5j），這表明A10-FMT和A100-FMT可能以相同的方式影響血液代謝物。30個代謝物在control vs Sa, Sa vs A10-FMT, and Sa vs A100-FMT共有，其中15個代謝物被busulfan (in control vs. Sa)誘導顯著增加，而A10-FMT和A100-FMT使其顯著減少（Sa vs A10-FMT和Sa vs A100-FMT；圖5k），表明，A10-FMT和A100-FMT對血液代謝組產生了顯著改善。這30種代謝物中大部分是脂類分子，在小腸功能中起著重要作用，這表明A10-FMT/A100-FMT在血液中恢復了那些被busulfan擾亂的代謝物。
（a-c）不同處理組中差異代謝物的聚類分析結果；
（d-f）不同處理組中的OPLS-DA分析；
（g-i）不同處理組中差異代謝物的相關性分析；
（j-k）不同處理組中共有代謝物的表達聚類分析；
顯著變化代謝物的KEGG代謝通路分析表明：choline metabolism in cancer、glycerophospholipid metabolism、retrograde endocannabinoid signaling、linoleic acid metabolism、glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor biosynthesis這些通路在Sa vs Con-FMT、Sa vs A10-FMT和Sa vs A100-FMT共同富集（圖6a-c）。fat digestion and absorption、cholesterol metabolism、carbohydrate digestion and absorption、vitamin digestion and absorption 在A100-FMT中特異性富集（圖6a-c）。這些途徑反映了A10-FMT和A100-FMT在改善小腸功能方面的優勢。用Spearman相關係數分析血液代謝物與腸道菌群的相關性（圖6d），結果表明：血液代謝物分為兩組（上下）；大部分代謝物在control vs Sa中增加，而A10-FMT和A100-FMT使其減少。菌群也被分成兩大類（左和右），上簇中的代謝物與右簇中的微生物呈正相關，而下簇中的代謝物與左簇中的微生物正相關。Lactobacillales與上簇代謝產物呈正相關，這表明「有益菌」乳酸桿菌有助於血液代謝產物的恢復。同時，Mycoplasmatales與下簇代謝物呈正相關，這表明「有害菌」支原體不能協助血液代謝物的回收。提示A10-FMT和A100-FMT可改善小腸功能和腸道菌群，恢復血液代謝。
圖6 | FMT處理後血漿代謝物的代謝通路分析及相關性分析
（a-c）不同處理組中差異代謝物的代謝通路分析；
（d）代謝物與腸道菌群的相關性分析；
在目前的研究中，AOS-dosed的FMT通過調控基因表達和提高細胞連接蛋白來明顯改善小腸。AOS-dosed的FMT通過增加「有益菌」Leuconostocaceae和促使血液代謝組學的恢復來發揮其腸道菌群的優勢。FMT從一個具有優良微生物的供體誘導了小腸功能的恢復。表明AOS處理的腸道微生物群供體可用於預防化療藥物或其他因素在受體中引起的小腸黏膜炎。
本文通過LC-MS非靶向代謝組、16s微生物多樣性、轉錄組等多種檢測手段發現了海藻酸鈉寡糖（AOS）是從海藻酸鈉降解中得到的天然產物，AOS通過增強細胞連接、恢復小腸功能以及改善可能有助於基因表達的轉錄因子來改善busulfan幹擾的腸細胞膜；AOS改善血液代謝，以支持小腸功能的恢復；AOS可能通過增加「有益」腸道微生物和減少「有害」腸道微生物而有益於腸道微生物群。AOS-dosed的FMT證明可以有效地控制腸道微生物群，改善化療引起的黏膜炎。
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部分參考文獻：
Zhang P, Liu J, Xiong B, et al. Microbiota from alginate oligosaccharide-dosed mice successfully mitigated small intestinal mucositis. Microbiome. 2020;8(1):112. Published 2020 Jul 25. doi:10.1186/s40168-020-00886-x.
白小妙 撰文
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