前言
2020年10月歐易/鹿明生物合作客戶山東中醫藥大學附屬醫院心病科楊傳華教授課題組聯合山東中醫藥大學第一臨床醫學院在Journal of Ethnopharmacology期刊發表的題為「Banxia Baizhu Tianma decoction attenuates obesity-related hypertension」的研究成果，通過LC-MS非靶向代謝組學研究方法，探索了BBTD對氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）的內皮保護作用，通過轉錄組測序，發現了BBTD在抗ox-LDL，保護血管內皮細胞的可能靶點。為治療肥胖相關性高血壓病症提供進一步的理論依據。
中文標題：半夏白朮天麻湯減輕肥胖相關性高血壓病症
研究對象：小鼠血漿
發表期刊：Journal of Ethnopharmacology
影響因子：3.690
發表時間：2020.10.8
合作單位：山東中醫藥大學臨床醫學院、山東中醫藥大學附屬醫院
運用生物技術：LC-MS非靶代謝組學(由鹿明生物提供技術支持) 、轉錄組學
研究背景
經世界衛生組織（世衛組織）統計，2016年超過39%的人口超重（19億），肥胖人口佔比為13%（6.5億）。身體質量指數（BMI）的增加與收縮壓（SBP）和舒張壓（DBP）有著密切的關係。據統計，高達78%的男性和64%的女性原發性高血壓可歸因於肥胖。肥胖和高血壓的結合增加了動脈性高血壓的患病風險，並且會導致心血管疾病（包括冠心病、充血性心力衰竭、心源性猝死、終末期腎病和中風）的發病率及死亡率的增加。血管結構和功能的改變被認為是肥胖相關性高血壓的重要機制之一。內皮功能障礙和動脈硬化被認為是肥胖症血管功能障礙的最早表現，高血壓發病前，氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)是高血壓發生的重要危險因素。
雖然運動以及降低卡路裡的攝入對降低高血壓有效，但許多患者發現很難維持這一計劃，故採取藥物幹預措施。半夏白朮天麻湯（BBTD），是臨床治療高血壓及高血壓相關病症的常用中藥方劑。根據中醫理論和臨床實踐，BBTD特別適用於長期缺乏體力活動的高血壓患者。
但是，BBTD對於改善症狀效果的確切機制尚未完全闡明。這項研究根據非靶向代謝組學分析來評價BBTD對內皮細胞的保護作用。另外通過轉錄組測序，以研究BBTD在抗ox-LDL，保護血管內皮細胞的可能靶點。
研究思路
研究方法
1.實驗材料：
作者將雄性小鼠隨機分為高脂肪飲食（HFD組，n = 41）和陰性對照（NC組，n = 9）。選取體重大於NC組平均值的25%的27個HFD小鼠隨機分為BBTD組、米沙坦組（Telmisartan）、模型組。
代謝組學所用實驗材料為小鼠血漿。每組各7個生物學重複。
轉錄組測序所用實驗材料為經BBTD（2mg/mL）/未經BBTD處理的ox-LDL（50μg/mL）誘導的HAECs。
多組學分析：LC-MS非靶向代謝組學+轉錄組測序
2.檢測方法：
（1）生理生化實驗：小鼠體重、SBP和DBP測定；
（2）功能驗證實驗：油紅染色和HE染色觀察主動脈形態，免疫螢光染色觀察形態學變化，Western blot檢測蛋白表達量；
研究結果
1、BBTD可減輕體內與肥胖相關的高血壓
通過八周的BBTD給藥使肥胖相關性高血壓小鼠的SBP和DBP分別降低12.1 mmHg和10.5 mmHg（P <0.05）。BBTD和替米沙坦降低了小鼠的總膽固醇水平（P <0.05，圖1E）。油紅O染色顯示出模型小鼠動脈根部明顯的脂質沉積，而BBTD減弱了油紅O陽性範圍（圖1G）。HE染色證實了模型小鼠的血管平滑肌層增生和肥大，而BBTD改善了主動脈的形態（圖1H）。
圖1 | 半夏白竹天馬湯（BBTD）可在體內減輕肥胖相關高血壓
（A）具有代謝性的小鼠視覺外觀圖片
（B）體重(n = 9)。（注:*P < 0.05， **P < 0.01）
（C）收縮壓(n = 9)。
（D）舒張壓(n = 9)。
（E）血漿總膽固醇(n = 9)。
（F）血漿甘油三酯(n = 9)。
（G）動脈根部油紅染色的代表性圖片。
（H）主動脈HE染色的代表性圖片(x 200)。
2、BBTD調節小鼠血漿中的代謝產物
作者通過LC-MS非靶向代謝組學分析模型組和BBTD組小鼠血漿，共鑑定出94種差異代謝物。代謝組學結果顯示，BBTD主要影響甘油磷脂（共24種:11種甘油乙醇胺、5種甘油磷酸酯、5種氧化甘油磷脂、2種甘油磷酸酯膽鹼和1種甘油肌醇聚糖），其次是脂肪醯基(共10種)。KEGG富集顯示（圖2D）BBTD組小鼠受影響的主要途徑為鞘磷脂信號通路、逆行性內源性大麻素信號通路、鞘磷脂代謝、液體剪切應力和動脈粥樣硬化。其中，液體剪切應力和動脈粥樣硬化與內皮功能障礙和肥胖相關高血壓密切相關。
圖2 | 半夏白竹天麻湯（BBTD）調節血漿代謝產物
（A）模型組和BBTD組PCA圖（n=7）。
（B）模型組和BBTD組OPLS-DA圖（n=7）。
（C）模型組和BBTD組聚類熱圖（n=7）。
（D）差異代謝物的KEGG代謝通路富集圖。
3.BBTD對氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)的內皮保護作用
考慮到ox-LDL是導致內皮損傷的最重要因素之一，作者研究了BBTD對ox-LDL誘導的內皮細胞的影響。Ox-LDL使HAEC中的細胞凋亡率從4.4％增加到32.8％，達到7.4倍，而BBTD以劑量依賴性方式降低細胞凋亡率（圖3A）。Ox-LDL顯著抑制細胞遷移，誘導HAEC的細胞骨架萎縮。相反，BBTD則以劑量依賴性方式改善細胞遷移，說明BBTD處理有效地維持了細胞形態（圖3B和3C）。另外，Ox-LDL誘導了VE-鈣粘蛋白的濃縮密度，而BBTD降低了VE-鈣粘蛋白的密度（圖3D）。
圖3 | 半夏白朮天麻湯對氧化低密度脂蛋白（ox - LDL）的內皮保護作用
經24小時的BBTD處理（2mg/mL）/未經BBTD處理的ox-LDL（50μg/mL）誘導的HAECs (n = 3)。
（A）Annexin V-FITC/PI雙染色檢測細胞凋亡率。
（B）採用Transwell小室進行細胞遷移研究。
（C）在雷射共聚焦顯微鏡下用phalloidin染色觀察細胞骨架。
（D）雷射共聚焦顯微鏡下免疫螢光染色觀察VE-鈣粘蛋白的密度。
4. 差異表達的mRNA
轉錄組測序結果顯示，在ox-LDL組未處理的HAECs組中，ox-LDL誘導下HAECs中檢測到759個差異表達轉錄本。BBTD處理24小時後，BBTD 處理組和ox-LDL組中共鑑定出854個差異表達 mRNA（603個上調，251個下調）（FC>2， P<0.05）。BBTD逆轉了由ox-LDL誘導的mRNA（393 mRNA）中51.8％的變化（圖4B）。Western印跡分析證實了BBTD降低了ANGPTL4，PLIN2的蛋白表達，增加了SLCO4C1的蛋白表達（圖4C）。
通過DO富集分析（圖4D）發現經BBTD處理的HAEC細胞中的差異轉錄本富集在動脈硬化、冠心病、高血糖和高血壓中。GO分析（圖4E）表明BBTD對有絲分裂、次生醇、甾醇，以及膽固醇的生物合成和代謝過程有調控作用。KEGG富集（圖4F）表明類固醇生物合成，細胞周期，細胞粘附分子，甘油脂代謝，血管平滑肌收縮，p53信號通路和PPAR信號通路是顯著富集到的通路。
圖4 | HAECs人主動脈內皮細胞（HAECs）的轉錄組測序
（A）BBTD與ox-LDL差異表達(DE) mRNA的熱圖。
（B）ox-LDL與未處理HAECs(藍色)、BBTD與ox-LDL(黃色)的差異 mRNA維恩圖。
（C）Western blot檢測ANGPTL4、PLIN2和SLCO4C1表達量。
（D）BBTD與ox-LDL差異表達(DE) mRNA的DO富集。
（E）BBTD與ox-LDL差異表達(DE) mRNA的GO富集。
(F) BBTD與ox-LDL差異表達(DE) mRNA的顯著性富集pathway氣泡圖。
相關討論
BBTD是臨床治療肥胖性高血壓的常用中藥方劑，但其藥理機制仍不清楚。本實驗旨在探討BBTD對高脂飲食致肥胖性高血壓小鼠的影響機制。研究表明，BBTD可有效降低肥胖相關性高血壓小鼠的體重， SBP和DBP。在本研究中，BBTD的降壓效果不如替米沙坦（降血壓藥物），但其減肥效果優於替米沙坦。BBTD能降低血漿總膽固醇水平，減輕動脈根的脂質沉積，緩解血管平滑肌細胞層增生肥厚並有助於提高動脈順應性，從而降低血壓。經BBTD處理後主動脈結構的改善可能是BBTD的重要藥理機制之一。
基於代謝組學分析，BBTD主要影響甘油磷脂和脂醯基。生物信息學分析表明鞘脂代謝和液體剪切應力是動脈粥樣硬化的主要途徑。通過體外實驗，表明BBTD具有內皮保護作用，可降低細胞凋亡率，並呈劑量依賴性改善細胞遷移，維持細胞形態。基於轉錄組測序分析，發現BBTD降低了ANGPTL4和PLIN2的蛋白表達，該結果表明BBTD可能通過調節脂質代謝來降低心血管疾病的風險。另一方面，BBTD增加了SLCO4C1蛋白的表達，表明其可能通過消除尿毒症毒素，減輕高血壓和腎臟炎症從而降低肥胖和高血壓的患病風險。
研究結論
在這項研究中，通過動物實驗和細胞學研究，整合代謝組學和轉錄組學分析技術，探究BBTD對高脂飲食導致肥胖性高血壓潛在的影響機制。該研究發現BBTD具有減輕肥胖相關性高血壓的作用，並體現了中藥方劑的多靶點效應。
小鹿推薦
本研究首先根據非靶向代謝組學分析來評價BBTD對內皮細胞的保護作用。隨後藉助轉錄組測序，以研究BBTD在抗ox-LDL，保護血管內皮細胞的可能靶點。從而為解析BBTD減輕肥胖相關性高血壓病症的作用機制提供進一步的理論依據。這項基於非靶代謝組學和轉錄組學的研究為探索中藥方劑通過抑制ox-LDL刺激內皮細胞產生的損傷，達到保護心血管的作用機制提供了實用的研究策略。
參考文獻：
1.Chaurasia, B.，et al. 2016. Adipocyte ceramides regulate subcutaneous adipose browning, inflammation, and metabolism. Cell Metabol. 24 (6), 820–834.
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3.Kersten, S., 2019. New insights into angiopoietin-like proteins in lipid metabolism and cardiovascular disease risk. Curr. Opin. Lipidol. 30 (3), 205–211.
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文章來源於鹿明生物