前言
2020年，伊利諾伊大學食品科學與人類營養系課題組在Food Chemistry雜誌（IF=5.8）發表題為「A comparison of the absorption and metabolism of the major quercetin in brassica，quercetin-3-O-sophoroside，to that of quercetin aglycone, in rats」的研究論文。該研究運用LC-MS代謝組學及GC-MS代謝組學技術以羅布麻中提取的槲皮素-3-O-槐苷為原料，採用大鼠原位腸道模型，對其吸收、Ⅱ期代謝及微生物分解代謝進行了研究，並與槲皮素苷元進行了比較。
標題：蕓薹屬植物槲皮素-3-O-槐苷與槲皮素苷在大鼠體內吸收代謝的比較
期刊：Food Chemistry
影響因子：5.8
運用生物技術：LC-MS代謝組學、GC-MS代謝組學
研究背景
黃酮類化合物因其在預防慢性疾病（包括心血管疾病和癌症）中促進健康的作用而被廣泛認可。槲皮素是一種常見的黃酮類化合物，廣泛存在於植物性食品和飲料中。與大多數黃酮類化合物一樣，槲皮素通常以多種糖苷形式存在於自然界中，而不是以游離苷元的形式存在。槲皮素-3-O-槐苷（QS）是人們特別感興趣的一種黃酮類化合物，它是西蘭花中的一種主要黃酮類化合物，而西蘭花是公認的抗癌和抗炎食品。
近年來，食品與微生物之間的相互作用越來越引起人們的興趣。所有類型的黃酮苷類都會部分轉移到腸道下部，在那裡宿主體內缺乏的微生物酶會進行廣泛的分解代謝。微生物分解代謝包括槲皮素苷的脫糖基化為苷元，隨後發生環分裂，導致形成多種生物活性酚酸，包括苯甲酸、苯乙酸和苯丙酸衍生物。
本研究以羅布麻中提取的槲皮素-3-O-槐苷為原料，採用大鼠原位腸道模型，對其吸收、Ⅱ期代謝及微生物分解代謝進行了研究，並與槲皮素苷元進行了比較。
研究思路
研究方法
1.實驗設計
從Envigo公司購買體重範圍140-160克的Fischer 大鼠344隻，單獨關在籠子裡，食物和水可隨意攝取。對大鼠進行為期6天的AIN93G粉末飲食的適應。手術前12小時飲食被取消。
通過空腸或盲腸給藥（每組n=3~4）給每隻大鼠注射QS或槲皮素苷元，收集門靜脈血並分析其代謝產物。對於空腸給藥，從空腸近端開始約20cm的節段通過結紮關閉。然後將15μmol槲皮素苷元或QS溶解在0.5ml丙二醇中，用2% DMSO溶解在結紮段的近端。注射後，取出針，近端立即結紮，形成封閉的空腸段，兩端結紮。盲腸給藥時，結紮整個盲腸，並在完全結紮前從結腸（遠端）端引入材料。
在材料導入之前，將導管插入門靜脈（離肝臟約2cm遠）以收集血液。在空腸給藥後10、20和30分鐘，盲腸給藥後0、60、90、120和150分鐘，用含60μl 2%EDTA的1 ml注射器抽取血液（600μl），以防止血液凝結。根據初步數據（未顯示）選擇時間點。手術後，對空腸給藥的大鼠，從體內取出空腸段，精確測量長度（19–24 cm）；對盲腸給藥的大鼠，收集盲腸內容物，並在-80°C下冷凍，直到分析。手術後立即將血樣保存在冰上並離心收集血漿。
2.檢測方法
從血液樣本中製備血漿，以2400rpm/min（500×g）的速度離心15分鐘，在4°C下離心兩次，然後在-80°C下冷凍，直到分析。使用三體積的含有0.1%甲酸的甲醇提取約300μL的血漿樣品。該混合物在10分鐘內每2分鐘渦旋30秒，在16100×g離心10分鐘後，在氮氣下將上清液（約1.2毫升）濃縮至約100μl。再離心後，測量上清液的體積，在LC-MS上進行定性分析，並分別在HPLC-PDA上進行定量分析。
盲腸內容物冷凍乾燥。測量100 mg乾燥樣品並在70%甲醇中浸泡。將樣品在18000×g下離心10min，重複超聲30秒，45秒，蒸發乾燥，用100μl N-三甲基矽基-N-甲基三氟乙胺（MSTFAA）衍生，進行酚酸的GC-MS分析。
採用圖基多重比較試驗（family wise α= 0.05）對酚酸測定的對數轉換數據（base e）進行單因素方差分析。用Shapiro-Wilk檢驗正態分布（p≤0.05），用Brown-Forsythe檢驗方差齊性（p<0.05）。使用GraphPad Prism8進行分析。
研究結果
「槲皮素-3-O-槐苷（QS）的吸收與Ⅱ期代謝」，空腸引入QS後，完整的QS和QS的四個II期代謝物均在門脈血漿中被鑑定（表1和圖1）。
表1 | 所有II期代謝產物的完整列表
圖1 | 引入槲皮素苷元或槲皮素-3-O-槐苷（QS）後血漿II期代謝物的色譜圖
A圖：空腸內注入槲皮素苷元後30分鐘門靜脈血漿樣品的代表性HPLC痕量。盲腸引入aglycone後150min血漿中的代謝物模式相似，但豐度較低。
B圖：空腸引入QS後30分鐘門靜脈血漿樣品的代表性HPLC痕量。盲腸引入QS後未檢測到II期代謝產物或完整的QS。
這四種代謝產物包括硫酸QS（峰10）、甲基化QS（兩種異構體，峰13和峰14）和甲基化QS硫酸鹽（峰11）、兩種典型的Ⅱ期代謝活性產物、甲基化和硫酸化。另一個典型的II期代謝產物QS-葡萄糖醛酸沒有被觀察到，也沒有任何去糖基化產物，如槲皮素苷元、槲皮素-3-O-葡萄糖苷或其II期代謝產物。空腸手術30分鐘後每10分鐘測定一次血漿QS的豐度（表2）。
表2 | 引入槲皮素苷元或槲皮素-3-Osophoroside（QS）後，對血漿中選定的II期代謝物進行量化並進行標準統計表
血漿Qs濃度隨時間延長，血漿中最大濃度為3.7±1.2μm，盲腸導入QS後，150 min時門靜脈血漿中無代謝產物或QS，無吸收。
表3 | 原位盲腸導入150分鐘後槲皮素苷元和槲皮素-3-O-槐苷（QS）的分解代謝統計
表3是原位盲腸導入150分鐘後槲皮素苷元和槲皮素-3-O-槐苷（QS）的分解代謝統計。由表3可以看的出苷元組和QS組之間的分解代謝模式沒有差異，除了間苯三酚，它只在苷元組觀察到。
研究結論
本研究成功地從羅布麻中分離出了純QS，並用MS2、1H NMR 和13C NMR對其結構進行了確證，比較了槲皮素及其苷元的吸收、Ⅱ期代謝和微生物分解代謝。隨著羅布麻中黃酮類化合物QS的成功純化和大鼠原位模型的建立，作者首次報導了黃酮類化合物在小腸中被完整吸收，在空腸中被代謝為硫酸、甲基化和甲基化硫酸鹽。
作者的數據表明，QS可能被盲腸微生物群脫糖基化為苷元，形成苯甲酸、苯乙酸和苯丙酸的衍生物，表明QS與微生物群之間存在著積極的相互作用。新的發現表明，QS在上消化道完全吸收而沒有去糖基化，這表明終糖和（或）糖苷部分之間的連接類型可能在類黃酮糖苷的吸收機制中起作用。如果吸收涉及SGLT1或GLUT所屬類型則需要進一步的研究來確定通過空腸壁吸收QS的轉運系統，正在進行的研究表明，通過一些黃酮類化合物與這些轉運蛋白結合可能抑制糖的攝入，為糖尿病和肥胖症的控制提供了新的見解。
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本文作者運用LC-MS代謝組學和GC-MS代謝組學對槲皮素苷與槲皮素苷吸收、Ⅱ期代謝及微生物分解代謝進行了研究，並與槲皮素苷元進行了比較。作者發現了QS可能被盲腸微生物群脫糖基化為苷元，形成苯甲酸、苯乙酸和苯丙酸的衍生物，表明QS與微生物群之間存在著積極的相互作用。QS在上消化道完全吸收而沒有去糖基化，這表明終糖和（或）糖苷部分之間的連接類型可能在類黃酮糖苷的吸收機制中起作用，通過一些黃酮類化合物與一些轉運蛋白結合可能抑制糖的攝入，為糖尿病和肥胖症的控制提供了新的見解。這篇文章應用到了LC-MS/MS和GC-MS代謝組學現代最流行的質譜技術，十分值得借鑑。
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部分文獻參考
1.Jeffery,E. H., & Araya, M. (2009). Physiological effects of broccoli consumption. Phytochemistry Reviews, 8(1), 283–298.https://doi.org/10.1007/s11101-008-9106-4.
2.Lai, R.-H., Miller, M. J., & Jeffery, E. (2010). Glucoraphanin hydrolysis by microbiota in the rat cecum results in sulforaphane absorption. Food & Function, 1(2), 161–166.
https://doi.org/10.1039/c0fo00110d.
3.Liu, X., Wang, Y., Hoeflinger, J. L., Neme, B. P., Jeffery, E. H., & Miller, M. J. (2017).
Dietary broccoli alters rat cecal microbiota to improve glucoraphanin hydrolysis to
bioactive isothiocyanates. Nutrients, 9(3), https://doi.org/10.3390/nu9030262.