iTRAQ蛋白質組學、GC-MS代謝組學對柑橘黃龍病影響果肉風味研究

2019年2月佛羅裡達大學Frederick G. GmitterJr教授課題組在Horticulture Research發表了題為 「Proteomic and metabolomic analyses provide insight into the off-flavour of fruits from citrus trees infected with 『Candidatus Liberibacter asiaticus』」的研究成果，通過蛋白質組學和代謝組學研究方法，對被柑橘黃龍病菌感染的柑橘樹果實進行了基於蛋白質和代謝物的代謝通路分析，探究了症狀果實異味的機理。

中文標題：蛋白質組學和代謝組學分析為被柑橘黃龍病菌感染的柑橘樹的水果異味提供深入理解

研究對象：柑橘黃龍病菌

發表期刊：Horticulture Research

影響因子：5.404

運用生物技術：iTRAQ蛋白質組學、GC-MS代謝組學

研究背景

柑橘黃龍病菌（Candidatus Liberibacter asiaticus，CaLas）是誘導黃龍病的主要病原體，其可以存在於葉片、樹皮、根、花和果實中。黃龍病不僅減少了柑橘類水果的數量，而且影響了水果的質量。

在黃龍病的影響下：

1、果實較小，不對稱且偏斜，種子較小；

2、有症狀的果實的軸彎曲，果實的中央維管束變成深黃橙色至褐色；

3、果實成熟時，果實的表面也可以呈綠色；

4、成熟水果酸度較高，具有苦味、刺激性、金屬味和許多異味。

儘管已有研究報導了通過代謝組學方法了解柑橘黃龍病菌對橙汁風味的影響，但對黃龍病導致水果出現異味機理尚不清楚。

研究思路

實驗結論

1.CaLas檢測和黃龍病影響的水果症狀

作者從商業柑橘林中選擇健康和受CaLas感染的樹木，並用CaLas特異性引物通過qPCR進行確認。健康樹的葉子PCR陰性，而症狀樹的葉子PCR陽性。但是，無論是健康樹還是感染樹的果肉都無法檢測到CaLas。受黃龍病影響的果實與健康果實之間存在明顯的表型差異：有症狀的果實比健康的果實更小、更綠（圖1），且與健康水果相比，CaLas感染樹果實的可溶性固形物含量降低，而CaLas感染樹果實的可溶性酸含量比健康水果有所增加。

圖1 | Valencia嫁接在Swingle根莖上的果實

（A）黃龍病症狀；

（B）健康對照；

2. 初級和次級代謝中下調的蛋白質

總共有123種差異蛋白參與了糖分解和糖酵解，加爾文循環，三羧酸循環，胺基酸合成和分解，UDP糖，萜烯和苯丙烷代謝途徑的生物學過程（圖2）。糖和有機酸代謝涉及45種下調的蛋白質（圖3），胺基酸代謝涉及22種下調的蛋白質，萜類代謝涉及5種差異蛋白，3種下調蛋白參與果膠代謝（圖4）。

圖2 | 有症狀和健康水果之間的差異蛋白示意圖

紅色為上調，綠色為下調。

3.下調蛋白參與糖和有機酸代謝及體內穩態

與健康成熟果實中的蛋白質相比，蔗糖降解和糖酵解途徑中的大多數蛋白質均下調。蔗糖被蔗糖合酶（SUS）降解，生成果糖和UDP葡萄糖。CaLas感染樹的果實中SUS表達降低，果糖激酶蛋白豐度在有症狀的水果中發生了下調。UDP-葡萄糖可以通過參與糖酵解過程的UDP-葡萄糖焦磷酸化酶和UDP-糖焦磷酸化酶催化轉化為葡萄糖1P（圖3）。它也可以被UDP-葡萄糖脫氫酶催化轉化為UDP-葡萄糖醛酸（圖4）。在患病水果中這三種酶的水平均低於健康對照組。相反，CaLas下調了許多與丙酮酸代謝相關的蛋白質。磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和羧激酶的水平下降。丙酮酸脫氫酶複合物將糖酵解與TCA循環聯繫起來，其複合體中的相關蛋白在有症狀的水果中被下調。

圖3 | 與健康水果相比，黃龍病症狀水果的糖和有機酸代謝中的蛋白質下調。綠色方塊表示下調的酶。

4.糖，有機酸和胺基酸代謝的變化

代謝組學發現與健康對照組相比，有症狀甜橙果實中的蔗糖、果糖和葡萄糖濃度分別降低了26％，15％和20％，主要的有機酸檸檬酸和蘋果酸分別減少了6.50％和9.20％。而低含量有機酸包括富馬酸、奎尼酸和琥珀酸分別增加了48.06％，20.03％和54.82％。有症狀的水果中兩種酸性胺基酸，天冬氨酸和穀氨酸的含量降低，而以下中性胺基酸含量增加：丙氨酸（10.00％），天冬醯胺（128.12％），甘氨酸（31.58％），亮氨酸（73.66％），苯丙氨酸（79.44％），脯氨酸（20.57％），絲氨酸（74.14％），蘇氨酸（217.79％），色氨酸（61.83％）和纈氨酸（20.39％）。

圖4 | 與健康水果相比，黃龍病症狀水果的果膠代謝中的蛋白質下調。綠色方塊表示下調的酶。

5.萜類化合物代謝中涉及的萜類化合物和蛋白質水平降低

根據質譜峰鑑定和標準品確認，在果肉中共發現6種單萜和1種倍半萜，其含量在黃龍病症狀水果中均降低。相關的酶也在症狀水果中下調（圖5）。

圖5 | 單萜和倍半萜代謝中的差異蛋白。綠色下調，紅色上調。

相關討論

糖酵解是植物中重要的代謝途徑，它可以提供能量、產生丙酮酸，從而為TCA循環提供動力，還可以提供胺基酸，脂肪酸和次級代謝產物生物合成的前體。

從柑桔果實的膨大階段到果實成熟階段，大多數糖酵解酶都被上調。先前的報導顯示，糖酵解酶被下調的植物顯示出明顯的生長遲緩[參考文獻1]。本研究結果顯示，與健康水果相比，黃龍病症狀水果中17種參與糖酵解的蛋白質被下調，這可能是黃龍病中產生較小和未成熟果實的原因。

揮發性化合物在果皮，樹葉和其他柑橘類植物部位的油腺中產生，Valencene是一種倍半萜烯，是橙汁中檸檬烯之後的第二大豐富的萜烯，多年來已被用作質量和成熟度標記[參考文獻2]。本文實驗結果發現黃龍病症狀水果中Valencene的豐度降低，這表明其沒有以正常的方式成熟。

甘油醛-3-P和丙酮酸是糖酵解過程中的中間產物，為水果中萜類化合物的生物合成提供了碳骨架。本文研究中，黃龍病症狀水果中的六種催化從葡萄糖和果糖到甘油醛-3-P的蛋白質含量低於健康水果。且與丙酮酸代謝相關的蛋白質水平在黃龍病症狀水果中也發生了下調。黃龍病症狀水果中這些蛋白的含量與未成熟的水果相似。

實驗結論

對受柑橘黃龍病菌感染樹木的柑橘類果肉進行的研究結果顯示，糖、有機酸代謝、體內穩態和萜類化合物代謝受到顯著抑制和代謝功能障礙。這些抑制和失調會破壞蛋白質、糖、有機酸和揮發物的生產，導致有症狀果肉中糖和萜類化合物的含量降低，從而引起從這種水果生產的果汁中的許多負面特性。

小鹿推薦

感染柑橘黃龍病菌的橙樹果實通常看起來並不完全成熟，並表現出苦味、刺激性和金屬感等異味，且導致黃龍病症狀水果出現異味的機理尚不清楚。本文作者結合蛋白質組學和代謝組學，對糖、有機酸、體內穩態和萜類化合物代謝等代謝通路進行了詳細分析，這些酶和代謝物含量的下調與症狀果實未成熟的表型相互印證。作者對代謝組學的分類檢測和通過蛋白質組學對代謝通路酶的檢測有助於更全面的了解代謝通路的變化，其實驗思路值得借鑑和參考。

部分參考文獻：

[1] Rosa-Téllez, S. et al. Phosphoglycerate kinases are co-regulated to adjust metabolism and to optimize growth. Plant Physiol. 176, 1182–1198 (2018).

[2] Elston, A., Lin, J. & Rouseff, R. Determination of the role of valencene in orange oil as a direct contributor to aroma quality. Flavour Fragr. J. 20, 381–386 (2010).

[3] Yao L , Yu Q , Huang M , et al. Proteomic and metabolomic analyses provide insight into the off-flavour of fruits from citrus trees infected with &39;[J]. HORTICULTURE RESEARCH, 2019, 6(1).

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文章來源於鹿明生物