iTRAQ蛋白組學助力寧波大學越冬期間擬穴青蟹代謝變化研究

前言

2020年10月歐易/鹿明生物合作客戶寧波大學（一作作者：李娜，通訊作者：王春琳、王歡）課題組在Ecotoxicology and Environmental Safety發表的題為「The iTRAQ-based quantitative proteomics reveals metabolic changes in Scylla paramamosain under different light intensities during indoor overwintering 」的研究成果，通過iTRAQ蛋白質組學研究方法，以探索揭示越冬期間不同光照強度下擬穴青蟹的代謝變化。

中文標題：iTRAQ蛋白組學揭示越冬期間不同光照強度下擬穴青蟹的代謝變化

研究對象：肝胰腺組織

發表期刊：Ecotoxicology and Environmental Safety

影響因子：4.872

發表時間：2020年10月

合作單位：寧波大學

運用歐易/鹿明生物技術：iTRAQ蛋白質組學(由鹿明生物提供技術支持)

研究背景

擬穴青蟹（Scyla paramamosain）表現出高豐度，快速生長，高營養價值和強大的適應性，這使其對中國的野生漁業和水產養殖產生了巨大的影響。在過去的幾十年中，中國的擬穴青蟹養殖發展迅速。但是，中國擬穴青蟹的單產低，無法滿足不斷增長的市場需求。母蟹的質量和養殖是人工育苗的基礎。越冬是母蟹最常見的生物學特徵之一，也是擬穴青蟹對不利自然條件的保護反應。許多因素會影響擬穴青蟹的越冬，例如溫度，鹽度，光照和pH。在水環境中，由於浮遊生物，懸浮顆粒物和可溶性有機物的影響，入射光的吸收和反射很容易改變，這會影響水中的光強度，因此，光強度被認為是越冬期間的重要因素。

先前關於光強度對動物影響的研究主要集中在膚色，行為，存活和生長，蛻皮和幼體變態，荷爾蒙分泌和應激反應，尚未研究光強度對擬穴青蟹的潛在分子機制。本研究採用iTRAQ蛋白組技術，比較了不同光強度下室內越冬後肝胰腺蛋白質組的定量變化。這項研究將有助於解釋驅動在不同光強度下越冬的擬穴青蟹性狀的潛在分子機制。

研究思路

研究結果

1、蛋白質組學數據的qRT-PCR驗證

使用qRT-PCR定量檢測20種已鑑定DEPs（CNDP，ALT2，GCDH，IMPA2，CYC1，ASAA，FATP4，PIPSAC1，ADSS1A，RDH11，CFB，DB18，BODG，HCDH，APT，LvP5CDh，TPIB，GK，APRT和FABP）的mRNA轉錄水平以驗證蛋白質組結果。針對10個隨機選擇基因的qRT-PCR結果所示，除TPIB，FATP4和RDH11外，大多數轉錄物表現出與iTRAQ結果相似的表達變化。總體而言，qRT-PCR與蛋白組學基本一致，證明了蛋白組學結果的可靠性。

2、蛋白質組學鑑定結果

使用iTRAQ標記定量蛋白質組學測定擬穴青蟹的肝胰腺樣本，從45886個已知譜圖中檢測到21812個肽段，19983個unique肽段和3282個蛋白（圖1a）。60.82％的蛋白被不少於三個肽所覆蓋（圖1b），表明鑑定蛋白具有良好的序列覆蓋率。分子量10-20 kD（612），20-30 kD（586），30-40 kD（495），40-50 kD（430），50-60 kD（344）和60-70 kD（189）佔總蛋白的80.93％（圖1c）。此外，60％的蛋白表現出超過10％的序列覆蓋率，而38％的蛋白表現出超過20％的序列覆蓋率（圖1d）。

圖1 | iTRAQ標記定量蛋白質組學

（a）iTRAQ蛋白質組學的基本統計數據；

（b）不同unique肽段的蛋白分布；

（c）不同分子量蛋白的分布；

（d）蛋白的肽段覆蓋統計；

3、差異蛋白篩選鑑定

用火山圖比較顯示了LL組，HL組和對照組的整體肝胰腺蛋白質組的差異，結果表明：與對照組相比，LL組（圖2a）和HL組（圖2b）的蛋白表達水平發生了顯著變化。聚類分析顯示，相似的樣本在距離上相似，因此聚在一起（圖3a和3b）。

圖2 | 火山圖顯示擬穴青蟹肝胰腺樣本中的DEPs

圖3 | 擬穴青蟹肝胰腺樣本中DEPs的聚類分析

在LL組中，有267種蛋白發生了明顯變化，其中122種上調（佔45.69％）和145種下調（佔54.31％）（圖4a）。

胺基酸轉運和代謝途徑中三種高度上調蛋白是凝血因子B（Q27081），甲硫氨酸腺苷轉移酶2亞基β（Q566L8）和pyridoxal-dependent decarboxylase domain-containing protein 1（Q99K01）。三種高度下調的蛋白是二甲基甘氨酸脫氫酶（Q9DBT9），甜菜鹼-同型半胱氨酸S-甲基轉移酶1（Q5I597）和4-氨基丁酸酯氨基轉移酶（P80147）。

在碳水化合物轉運和代謝途徑中，僅UDP glucuronosyltransferase 2B18（O97951）顯著上調；三個高度下調蛋白是dolichyl pyrophosphate Man9GlcNAc2 alpha-1, 3-glucosyltransferase (Q802T2), fumarylacetoacetase (A5PKH3)和 triosephosphate isomerase B (Q90XG0) 。

在能量途徑中，三種高度上調蛋白是NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 subunit C2 (Q02827), phosphoenolpyruvate carboxykinase [GTP] (Q16822)和malate dehydrogenase (Q5NVR2)；三種高度下調的蛋白是solute carrier family 25 member 35 (A3KPP4), aldehyde dehydrogenase (P11884)和V-type proton ATPase subunit S1 (O54715) 。

在脂質轉運和代謝途徑中，三種高度上調蛋白是hydroxyacyl-coenzyme A dehydrogenase (Q16836), gamma-butyrobetaine dioxygenase (Q9QZU7)和alkylglycerol monooxygenase (A0JPQ8) ；三種高度下調蛋白是phytanoyl-CoA dioxygenase, peroxisomal (P57093), alpha-methylacyl-CoA racemase (O09174)和succinate-hydroxymethylglutarate CoA-transferase (Q7TNE1) 。

在核苷酸的運輸和代謝途徑中，只有adenine phosphoribosyltransferase (P54363) 被顯著上調；5』-nucleotidase (Q05927)和dihydropyrimidinase (Q63150) 顯著下調。

在次生代謝途徑中，細胞色素P450 3A41（Q9JMA7）和protein white （P10090）明顯下調。

圖4 | 不同光強度的擬穴青蟹肝胰腺樣本中DEPs的分布

在HL組中，299種蛋白發生了明顯變化，其中252種蛋白（84.28％）顯著上調，三種上調程度最高的蛋白是glutaryl-CoA dehydrogenase (Q2KHZ9), cytosolic non-specific dipeptidase (Q96KP4)和3-hydroxyanthranilate 3,4-dioxygenase (P46952)；下調最顯著的兩個蛋白是dimethylglycine dehydrogenase (Q9DBT9)和cystathionine gamma-lyase (Q8VCN5)。

在碳水化合物代謝途徑中，三種上調程度最高的蛋白是N-acetylglucosamine-6- phosphate deacetylase (Q6P0U0), phosphoacetylglucosamine mutase (F1RQM2)和 UDP-sugar transporter UST74c (Q95YI5)；只有alpha-amylase (P91778) 被顯著下調。

在能量代謝途徑中，三種高度上調的蛋白是NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 alpha subcomplex subunit 6 (Q0MQA4), cytochrome c1, heme protein (Q9D0M3)和inorganic pyrophosphatase (O77460) ；V-type proton ATPase 16 kDa proteolipid subunit (P55277) 顯著下調。

在脂質轉運和代謝途徑中，三種上調程度最高蛋白是estradiol 17-beta-dehydrogenase 8 (P50171), diphosphomevalonate decarboxylase (Q62967)和acetyl-coenzyme A synthetase, cytoplasmic (Q9NR19) ；Phytanoyl-CoA dioxygenase (P57093) 顯著下調。

在核苷酸轉運和代謝途徑中，三種上調的蛋白是cytochrome P450 3A41 (Q9JMA7), cytochrome P450 3A24 (Q29496)和cytochrome P450 2L1 (Q27712) 。

有趣的是，這兩個比較組共有39個DEP（圖4b），包括參與細胞代謝的Phytanoyl-CoA dioxygenase (P57093) 和 dimethylglycine dehydrogenase (Q9DBT9)。

4.差異蛋白的功能富集分析結果

關於BP，差異蛋白主要參與生物調節，細胞組分，細胞過程，代謝過程，發育過程，細胞定位，對刺激的反應和信號傳遞。關於CC，差異蛋白質主要與

cell, cell part, extracellular region, extracellular region part, macromolecular and macromolecular complex, membrane, membrane part, membrane-enclosed lumen, organelle, and organelle part有關。關於MF，差異蛋白主要參與antioxidant activity, binding, enzyme regulator activity, catalytic activity, molecular transducer activity, transporter activity, and structural molecule activity（圖5）。

圖5 | 擬穴青蟹肝胰腺樣本中DEP的GO富集分析

與代謝相關的途徑進一步細分為12個子集：xenobiotics biodegradation and metabolism (LL: 6; HL: 6)、核苷酸代謝(LL: 7; HL: 7)、metabolism of terpenoids and polyketides (LL: 4; HL: 2)、其他胺基酸代謝 (LL: 4; HL: 6)、輔因子和維生素代謝(LL: 10; HL: 10)、脂質代謝 (LL: 10; HL: 16)、糖類生物合成和代謝(LL: 8; HL: 6)、global and overview maps (LL: 10; HL: 11)、能量代謝(LL: 11; HL: 13)、碳水化合物代謝(LL: 11; HL: 17)、次級代謝的生物合成(LL: 13; HL: 2)和胺基酸代謝(LL: 13; HL: 12)（圖6）。

LL組DEP富集到164條KEGG通路（圖6a），top 20表現出明顯變化（圖6c），其中7條pathway與代謝相關，如other types of O-glycan biosynthesis (ko00514), nicotinate and nicotinamide metabolism (ko00760), protein processing in endoplasmic reticulum (ko04141), geraniol degradation (ko00281), riboflavin metabolism (ko00740), pantothenate and CoA biosynthesis (ko00770), and regulation of lipolysis in adipocytes (ko04923) 。HL組DEP富集到205條KEGG途徑（圖6b）。top 20表現出明顯變化（圖6d），其中10條pathway與代謝相關，如glycosaminoglycan biosynthesis-keratin sulfate (ko00533), nucleotide excision repair (ko03420), linoleic acid metabolism (ko00591), folate biosynthesis (ko00790), mucin type O-Glycan biosynthesis (ko00512), lysine biosynthesis (ko00300), benzoate degradation (ko00362), nicotinate and nicotinamide metabolism (ko00760), ovarian steroidogenesis (ko04913), and arginine biosynthesis (ko00220)。

圖6 | 擬穴青蟹肝胰腺樣本中DEPs 的KEGG通路富集分析

選擇了與代謝相關的六個重要的2級重要子集，包括胺基酸轉運和代謝，碳水化合物代謝，能量代謝，脂質代謝，核苷酸轉運和代謝以及次級代謝產物的生物合成等，作為特異性代謝通路。

實驗結論

採用iTRAQ標記定量蛋白質組學技術研究在不同光強度下擬穴青蟹中蛋白表達變化。與細胞應激有關的蛋白PGD和RDH11在高光強度下顯著上調，表明高光可能會誘導擬穴青蟹產生應激。由於有機體需要更多的能量來滿足高光強度的要求，與能量產生相關的蛋白（包括GlcNAc-6-phosphate，PPase，ACSA，PGD和IMP）顯著上調表達。與高光狀態相比，低光狀態更適合於擬穴青蟹的生存，並且在生理過程中起重要作用的蛋白質（如APT和BODG）被顯著上調。由於這些過程消耗的能量較少，因此代謝過程中涉及的蛋白（如LvP5CDh，GK，TPIB和BH4）的表達顯著下調。這些結果將有助於闡明控制水生動物能量代謝的調節機制，並使它們適應不同的光強度，也可能有助於從新的角度理解擬穴青蟹中不同光強度調節代謝的分子機制。

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通過iTRAQ標記定量蛋白質組學在不同光強度下擬穴青蟹中蛋白表達變化，其中與能量產生相關的蛋白（包括GlcNAc-6-phosphate，PPase，ACSA，PGD和IMP）顯著上調表達，代謝過程中涉及的蛋白（如LvP5CDh，GK，TPIB和BH4）的表達顯著下調。這些結果將有助於闡明控制水生動物能量代謝的調節機制，並使它們適應不同的光強度。

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參考文獻：

Li N, Zhou J, Wang H, Mu C, Wang C. The iTRAQ-based quantitative proteomics reveals metabolic changes in Scylla paramamosain under different light intensities during indoor overwintering. Ecotoxicol Environ Saf. 2020 Oct 1;207:111384. doi: 10.1016/j.ecoenv.2020.111384. Epub ahead of print. PMID: 33011457.

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文章來源於鹿明生物