水稻抗旱機制突破研究——GCMS非靶向代謝組學

前言

本篇由上海市農業生物基因中心和華中農業大學植物科學技術學院（通訊作者羅利軍博士）團隊在Frontiers in Plant Science發表的 「Transcriptomic and Metabolomic Studies Disclose Key Metabolism Pathways Contributing to Well-maintained Photosynthesis under the Drought and the Consequent Drought-Tolerance in Rice」的文章，通過GC-MS非靶向代謝組學分析和轉錄組學技術，發現兩種代謝物在抗旱機制的重要作用，透徹地闡明了水稻耐旱性的分子基礎。

中文標題：轉錄組學和代謝組學研究揭示了有助於水稻在乾旱下光合作用及相應耐旱性的重要代謝途徑

研究對象：水稻

發表期刊：Frontiers in Plant Science

影響因子：4.106

運用生物技術：GC-MS非靶向代謝組學（由鹿明生物提供技術服務）、轉錄組測序

研究背景

與野生物種相比，農作物的耐旱性需要調動很多新陳代謝過程但是乾旱期間的光合作用調節以及相關的轉錄和代謝之間聯繫仍然未知。在本研究中，作者使用了兩個具有不同耐旱性的水稻品種（耐旱品種IRAT109和耐旱品種IAC1246）來探索長期乾旱的轉錄和代謝應答。經研究發現在進行性乾旱脅迫下，耐旱品種表現出較高的滲透調節和抗氧化能力，以及較高的相對光合作用速率，基於代謝組學的研究方法是篩選乾旱候選基因的有效方法。

研究思路

研究方法

1.實驗材料和分組

使用兩個抗旱水稻品種（IRAT109：低耐旱性；IAC1246：高耐旱性）。

實驗設計為單因素隨機區組，分6個時間點採集葉片樣品：（A）後分櫱期、（B）孕穗期、（C）孕穗期、（D）IRAT109抽穗期、（E）IAC1246抽穗期和（F）重新澆水。從土壤水分含量來看，將時間點A和B歸為輕度乾旱期（I），時間點C，D和E為重度乾旱期（II），時間點F為補水期（III）。

圖1 | 乾旱處理期間監測的土壤水分含量和相關的方差係數

2.測量生理性狀

相對含水量（RWC）、重量克分子滲透濃度、總抗氧化劑容量（AOC）、水稻收穫後的生物量和籽粒產量、抗旱性係數（乾旱脅迫田的穀物產量/水肥田的穀物產量）、光合作用速率；

3.轉錄組測序

4.定量表達基因和差異表達基因的鑑定

通過qPCR方法驗證了測得的基因表達水平，並選擇9個基因，包括已知的抗旱基因和幾個候選基因進行驗證。

5.基因本體和KEGG途徑的富集分析以及通過Mapman進行的綜合途徑分析

6.GC-MS非靶向代謝組學分析

實驗結果

1.IRAT109和IAC1246耐旱性和相關生理特性

在乾旱處理期間，土壤水含量在前12天（覆蓋A和B時間點）保持在18.0％以上，然後降低到小於15.0％（從C到E時間點覆蓋）（圖1）。土壤含水量變化係數的平均值為6.96％（圖1），表明土壤含水量均勻。

表1 | 水分充足（W）和乾旱條件（D）下測得的枯葉比例、生物量和穀物產量

通過葉片相對含水量（RWC）、滲透壓、總抗氧化劑容量（AOC）的差異可以看出（圖2，表1）, 兩個品種之間的耐旱性不同，與IAC1246相比，IRAT109的耐旱性要低得多（表1）。IAC1246的光合作用速率在乾旱早期表達水平正常，而IRAT109的光合作用速率則顯著降低（圖3A，B）。在乾旱條件下，IAC1246和IRAT109的光合作用速率均顯著下降（圖3A，B）。

圖2 | 樣品間耐旱性比較

葉片（A）相對水分含量（RWC，％），（B）重量克分子滲透壓，（C）乾旱處理期間（時間點A–E）和補水後（時間點F）測得的總抗氧化劑（AOC）能力調節

在整個乾旱期間，IAC1246的相對光合作用速率（乾旱/ CK中的CO2同化率）遠高於IRAT109（圖3C）。在乾旱期間，兩個品種的相對氣孔導度（乾旱中的氣孔導度/ CK中的氣孔導度）幾乎相似（IRAT109中稍高）（圖3F）。該結果表明IAC1246中較高的相對光合作用速率與氣孔導度無關。

圖3 | 在乾旱時期測得的葉片氣體交換參數

（A）IAC1246和（B）IRAT109和CO2同化率；（C）CO2相對同化率；IAC1246（D），IRAT109（E）中相對於水蒸氣的氣孔電導和相對氣孔電導率（F）

2. 在IRAT109和IAC1246識別的差異表達基因（DEG）

在乾旱時期，耐旱品種IAC1246的DEGs（範圍從548到766）比易旱品種IRAT109（範圍從916到1700）少（表2）。然而重新澆水後，與IRAT109相比，IAC1246中的DEG數量要高得多(表2）。作者僅在六個時間點（表2）檢測到IRAT109和IAC1246之間有限數量的共有DEG。基於總DEG的Log2FC進行的聚類分析支持通過土壤-水分將乾旱過程分為三個時期，在這個時期中，時間點C，D和E聚集在一起。有趣的是，IAC1246中所有DEG的平均絕對FC值在所有三個時期均顯著高於IRAT109，通過qPCR，驗證基因的FPKM值與其相對表達高度相關。

表2 | 在六個時間點下兩個品種IRAT109和IAC1246檢測到上調和下調的DEG數量

3. 特定材料和特定時期的DEG及KEGG / GO富集

在IRAT109和IAC1246中作者分別確定了4059和2677個DEG（圖4A，B）。對於IRAT109，在時期I，II和III分別發現了1750、2710和573個DEG，其中大多數是特定於時期的（圖4A）。對於IAC1246，在時段I，II和III分別找到了1081、1506和797個DEG，其中大多數也是特定於時段的（圖4B）。此外當比較同一時期兩個品種的DEG時，大多數DEG是特定品種的（圖4C-E）。

圖4 | 不同乾旱時期之間維恩圖

在IRAT109（A）和IAC1246（B）不同乾旱時期之間以及兩個品種在I（C），II（D）和III（E）時期之間的DEG維恩圖

KEGG途徑的富集還顯示了明顯的時期和品種特異性模式（圖5）。糖和胺基酸代謝的途徑優先在IRAT109富集。但是在IAC1246中，與抗氧化活性相關的途徑在乾旱期間富集（圖5）。

值得注意的是，作者發現II期在IAC1246中富集的幾種KEGG途徑在III期的IRAT109中更加豐富（圖5）。與KEGG途徑的富集相似，富集的GO項表現出明顯的品種和時期特異性結果，表明在這兩個品種中激活了不同的分子機制。例如「水跨膜轉運蛋白活性」和「水通道活性」在IRAT109中高度獨特地富集，而抗氧化劑相關的GO項在IAC1246中獨特地富集。

圖5 | 乾旱時期富集的KEGG途徑熱圖

IRAT109和IAC1246在三個乾旱時期富集的KEGG途徑熱圖

根據Mapman結果，IRAT109和IAC1246之間最明顯的差異是DEGs的上調，這些DEGs參與IAC1246中抗壞血酸和穀胱甘肽的光反應和代謝。但是相同的DEG在IRAT109（圖6）中被下調，尤其是在時間點A，B和F。此外在IRAT109檢測到更多參與OPP循環以及澱粉和蔗糖代謝的上調DEG（圖6）。

圖6 | 細胞代謝途徑概述

在IAC1246（A）和IRAT109（B）中通過Mapman分析的細胞代謝途徑概述

4.在IRAT109和IAC1246中滲透壓、AOC和光合作用相關DEG的調節

在IRAT109中，作者發現1200 個DEG（佔總DEG的29.6％）和268 個DEG（佔總DEG的6.6％）分別與滲透壓和AOC顯著相關。在IAC1246中，發現772個（佔總DEG的28.8％）和293個（佔總DEG的10.9％）DEG分別與滲透壓和AOC顯著相關，其中60個與滲透壓和AOC都相關。

作者發現IRAT109和IAC1246共享了241個常見的滲透壓相關的DEG和12個AOC相關的DEG（圖7A，B）。儘管這些常見的滲透壓相關DEG（圖7A）和AOC相關DEG（圖7B）的一般調節模式在IRAT109和IAC1246中相似，但作者發現它們在IAC1246有更高的調節幅度（圖7A，B）。

由於Mapman結果表明兩個品種之間光反應的普遍差異，作者特別關注了乾旱期間光合作用相關基因的調控。在IRAT109和IAC1246中總共48和64個與光合作用相關的基因表達有差異。與光合作用相關的DEG在IRAT109和IAC1246之間表現出不同的調節模式，尤其是在I期。在IAC1246中許多DEG基因上調，而在IRAT109中被下調（圖7C）。與光合作用相關的DEG相比，IRAT109和IAC1246中的葉綠體基因表現出相似的調控模式（圖7D），這提供了另外的證據表明兩個品種之間光合作用的效率不同。

圖7 | DEG變化

IRAT109和IAC1246（A）中常見的滲透壓相關DEG的Log2（倍數變化）；（B）AOC相關DEG；（C）與光合作用相關的DEG；（D）葉綠體DEG；

5.乾旱期間在IRAT109和IAC1246中檢測到的差異代謝物

作者分別在IRAT109和IAC1246中檢測到185和130種代謝物，其中兩個品種共有101種。在IRAT109和IAC1246中分別鑑定出總共69和47個差異代謝物（圖8A）。在IRAT109中，作者發現I和II期分別在乾旱脅迫和水分充足條件下分別有26種和55種代謝物顯著不同（圖8A）。在IAC1246中，分別在I和II期的乾旱脅迫和灌溉充足的條件下，有24種和37種代謝物具有顯著差異（圖8A表S9）。此外這兩個水稻品種之間幾乎沒有差異代謝物（圖8A）。

根據這些不同的代謝產物，通過PCA分析對IRAT109進行分離，從乾旱和水源充足的條件中分離樣品（圖8B）。但是對於IAC1246，這僅適用於灌溉條件良好的時間點C至E的乾旱脅迫樣品（圖8C）。

圖8 | 乾旱時期和品種之間差異代謝物的維恩圖

IRAT109（B）和IAC1246（C）中乾旱時期和品種之間的差異代謝物的維恩圖；（A）和基於差異代謝物的主成分分析（PCA）

在IAC1246和IRAT109中均可檢測到的45種代謝物被確定為IAC1246和/或IRAT109中的差異代謝物（圖9）。這些代謝物中的許多代表IAC1246和IRAT109之間的不同時間模式（圖9）。例如在乾旱時期I，IAC1246中阿魏酸和4-羥基肉桂酸的含量大大增加，而同期IRAT109中，阿魏酸和4-羥基肉桂酸的含量僅略有增加（圖9）。在時間點E，許多不同的代謝產物顯著上調，包括腐胺、5-甲氧基色胺、丙二酸、枯二酸、蔗糖、二羥基丙酮、3-羥基丁酸、氨基丙二酸、6-磷酸葡萄糖和硫氰酸苄酯（圖9）。但是作者發現IRAT109乾旱期間木糖醇和硬脂酸的含量增加，而IAC1246沒有明顯變化（圖9）。

圖9 | 差異倍數變化的熱圖

在IRAT109和IAC1246中均檢測到的差異倍數變化的熱圖

6.與IRAT109和IAC1246中的滲透壓、AOC和DEG相關的差異代謝物

在IRAT109中，作者發現了17種與滲透壓顯著相關的差異代謝物和4種與AOC顯著相關的代謝物。在IAC1246中，作者發現了10種與滲透壓顯著相關的代謝物和一種與AOC顯著相關的代謝物。在這些和滲透壓與AOC相關的代謝產物中，在IRAT109和IAC1246中均檢測到10種代謝產物。

IAC1246中35–1013個DEG與31種差異代謝產物顯著相關，而IRAT109中47–1559個DEG與22種差異代謝產物顯著相關。作者特別注意到4-羥基肉桂酸和阿魏酸，因為在早期乾旱時期IAC1246中它們被上調。IAC1246和IRAT109中有448和658個與4-羥基肉桂酸相關的DEG，分別包括0和17個與AOC相關的，347和157個滲透濃度相關的DEG，以及4和2個與光合作用相關的DEG。IAC1246和IRAT109中的1013和301 個DEG與阿魏酸相關，分別包括234和29個與AOC相關，599和17個與滲透壓相關以及5和0個與光合作用相關的DEG。一些與4-羥基肉桂酸和阿魏酸相關的DEG與它們自己的代謝途徑相關。

7.基於代謝物的耐旱候選DEG的研究方法

在IRAT109和IAC1246中檢測到的10種與滲透壓或AOC顯著相關的差異代謝物，有六種（D-阿拉伯糖醇，乳酸醯胺，帕拉金糖醇，4-羥基肉桂酸，氨基丙二酸和阿魏酸）表現出IAC1246和IRAT109不同的調節規律（圖9）。特別是在IAC1246和IRAT109中，4-羥基肉桂酸和阿魏酸均被確定為差異代謝物。與光合作用相關的DEG的上調一致，它們在IAC1246的早期乾旱期間表現出明顯的上調。另外，許多滲透壓和AOC相關的DEG與這些以及光合作用相關的DEG相關。這兩種代謝物涉及四個KEGG途徑（泛醌和其他萜類醌生物合成，酪氨酸代謝，苯丙氨酸代謝和苯丙烷類生物合成），其轉錄組數據也對其進行了補充（圖5，表3）。十二種滲透壓和/或與AOC相關的DEG參與了這四個途徑（表3）。如所預期的，這些DEG也與兩種代謝物相關。因此這些DEGs是改善耐旱性的有價值的潛在目標，因為它們可能調節4-羥基肉桂酸和阿魏酸代謝。

表3 |參與KEGG途徑的候選DEG與4-羥基肉桂酸和阿魏酸相關

相關討論

1.兩種栽培品種和試驗設計的對比抗旱性揭示了抗旱性的潛在分子基礎

通過轉錄組和代謝組學分析，為研究耐旱性的潛在分子基礎提供了很好的機會。

2.乾旱易感和耐旱品種的滲透調節和抗氧化能力的不同轉錄組和代謝組學基礎

本研究證實了兩個水稻品種的耐旱性分子基礎不同，尤其是在滲透調節方面。IRAT109傾向於激活糖代謝的途徑，而IAC1246則傾向於脂質代謝的途徑，以適應乾旱脅迫期間的滲透調節。

IAC1246的抗氧化能力相關DEG幾乎是IRAT109的兩倍。IAC1246似乎更多地依賴抗氧化劑，並且在該品種中許多生物過程以及黃酮和黃酮醇的生物合成更多。結果表明，獨特且高度調節的抗氧化劑體系可以作為IAC1246耐旱性提高的合理解釋。

3.維護良好的光合作用有助於提高耐旱性

在本研究報導中，耐旱性較高的水稻品種在乾旱條件下具有較高的生物量積累和籽粒產量。結果表明耐旱品種的光合作用水平提高或保持良好，歸因於該耐性品種改良的滲透調節和抗氧化劑。

4.基於代謝物的候選基因在水稻中的耐旱性

在這項研究中，作者研究了兩個水稻品種的代謝途徑，特別是那些與光合作用相關DEG的表達增強有關的代謝產物。作者以代謝物為中心的方法來挖掘候選基因，參與這兩個關鍵代謝產物代謝途徑的DEGs將成為有希望改善水稻耐旱性的靶向基因。

實驗結論

在這項研究中作者評估了兩種不同耐旱性的水稻品種的轉錄組學和代謝組學差異。它們代表了不同的滲透調節作用和抗氧化能力，從而導致逐步乾旱期間光合作用的不同調節。代謝物在通過滲透調節和/或抗氧化劑機制保護脫水下的光合作用中起著至關重要的作用。因此代謝組學方法是探索乾旱候選基因的有效方法，應進一步研究代謝物與轉錄物對乾旱脅迫的反應，以發現更多有用的代謝物、途徑和基因。

小鹿推薦

這篇文章發表時間較早，但卻是一篇非常典型的轉錄組-代謝組聯合分析的文章。作者利用GC-MS非靶向代謝組學的結果，不僅找到與滲透度和總抗氧化劑容量相關的兩個代謝物，還找到了與之密切相關的差異基因群，而且合理解釋了耐旱性不同的兩種水稻的分子機制差異，該研究的實驗設計和研究思路都很清晰，可作為農業方向研究人員的參考。

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