精準靶向代謝組學助力首都師範大學證明擬南芥種子萌發機制

前言

2019年9月，歐易/鹿明生物合作客戶首都師範大學鞠傳麗教授在Journal of Experimental Botany（IF：5.908）雜誌在線發表了題為「Methionine Synthase 1 Provides Methionine for Activating AtGLR3.5 Ca2+ Channel and Regulating Germination in Arabidopsis」的研究論文，通過GC-MS靶向代謝組學證明了L-Met通過上調AtGLR3.5介導的細胞溶質Ca2+信號促進擬南芥種子萌發。

中文標題：甲硫氨酸合酶1為激活AtGLR3.5Ca2+通道和調節擬南芥種子萌發提供甲硫氨酸

研究對象：擬南芥

發表期刊：Journal of Experimental Botany

影響因子：5.908

合作單位：首都師範大學

發表時間：2019年9月

運用歐易/鹿明生物技術：GC-MS靶向代謝組學（由鹿明生物提供技術支持）

研究背景

萌發是一個關鍵的發育過程，它將非休眠種子轉化為高度活躍的狀態，並對植物的生命周期和農業活動產生重大影響。萌發過程包括三個階段，包括幹種子的吸脹、代謝過程的重新啟動和胚根通過種子包膜的突出。萌發過程主要由內部信號級聯控制，例如與植物激素相關的信號級聯，包括脫落酸（ABA）和赤黴素（GAs），以及環境信號。前期的研究表明甲硫氨酸（Met）在種子萌發中起作用。然而，目前尚不清楚Met是否在AtGLR3.5介導的發芽控制中起作用，以及在這一過程中，胺基酸的來源是哪些細胞機制。

研究方法

研究結果

1.甲硫氨酸促進種子萌發

前期報導已經證明AtGLR3.5調節[Ca2+]和種子萌發。為了確定配體在萌發過程中如何調節AtGLR3.5活性，作者重點研究了已知在萌發過程中含量增加的胺基酸和已報導激活植物GLR Ca2+通道的胺基酸。為此，作者測試了生理濃度（10μM和30μM）下的L-Met、D-Ser、L-Asp和L-Thr在播種後36小時對擬南芥野生型（WT）種子發芽的影響，觀察到L-Met以劑量依賴的方式增強發芽，在30μM時效果最佳（圖1A，B）。

根據時間過程分析進一步證實，有L-Met存在的種子發芽比沒有L-Met的種子發芽快（圖1C）。由於L-Met對發芽的積極作用與我們之前觀察到的Ca2+處理相似，作者接下來測試L-Met的作用是否與Ca2+或Ca2+通道有關。因此，在L-Met與Ca2+通道阻滯劑LaCl3聯合處理後，檢查種子發芽率。發現LaCl3消除了L-Met的促進作用，導致發芽率低於對照（圖1D）。說明L-Met促進種子萌發的作用是通過Ca2+通道實現的，或L-Met激活Ca2+通道促進種子萌發的。

圖1 | L-甲硫氨酸（L-Met）促進擬南芥種子的萌發率

（A）不同L-Met濃度在生長培養基中的種子萌發。

（B）在生長室中存在或不存在30μM L-Met的情況下在36h的萌發表型。

（C）在有或無L-Met（30μM）的情況下種子萌發的時間過程。

（D）Ca2+通道阻滯劑LaCl3對種子萌發的Met調節作用。

2.AtGLR3.5介導L-Met依賴的種子萌發

由於AtGLR3.5對擬南芥種子萌發至關重要，並且具有Ca2+通道的功能，作者研究了它是否參與了種子萌發的L-甲硫氨酸調節控制。作者檢測了AtGLR3.5-RNAi系和AtGLR3.5 T-DNA插入系（AtGLR3.5-1和AtGLR3.5-2）中存在L-Met時的發芽率，結果顯示存在L-Me將會大大降低AtGLR3.5轉錄水平。與WT種子對L-Met的反應增強的發芽率相比，兩個獨立的AtGLR3.5-RNAi和兩個T-DNA插入系在使用L-Met濃度下的發芽率沒有明顯變化（圖2A，B），這表明AtGLR3.5在L-Met介導的發芽中起著關鍵作用。L-Met和CaCl2 的同時施用比單獨施用時更能提高野生種子的發芽率（圖2C）。這些結果表明，L-Met對種子萌發的調節作用涉及AtGLR3.5和Ca2+信號。

為了獲得L-Met調節[Ca2+]cyt中AtGlr3.5依賴性波動的直接證據，作者使用含有Ca指示蛋白YC3.60的植物進行了FRET敏化發射成像分析並監測[Ca2+]cyt變化的動力學。L-Met在WT幼苗的根細胞中觸發了[Ca2+]cyt的短暫增加，而這種反應在AtGLR3.5-RNAi幼苗中基本被消除(圖2D)。這些數據表明，L-Met激活了AtGLR3.5Ca2+通道，並在種子萌發過程中引起[Ca2+]cyt的增加。

圖2 | L-甲硫氨酸（L-Met）誘導擬南芥[Ca2+]cyt的AtGLR3.5依賴性增加

（A）不同濃度L-Met對野生型和AtGLR3.5-RNAi種子萌發的影響。

（B）不同濃度L-Met下WT和AtGLR3.5 T-DNA插入系（AtGLR3.5-1和AtGLR3.5-2）的發芽。

（C）不同處理對WT和AtGLR3.5-RNAi種子萌發的影響。

將種子播種在含有0 mM CaCl2（對照）、0 mM CaCl2和10μM L-Met、1 mM CaCl2、1 mM CaCl2和10μM L-Met、0 mM CaCl2和10 mM EGTA的改良MS培養基上，或添加10μM L-Met和10 mM EGTA的0 mM CaCl2上，在22℃下孵育36h後對發芽率進行評分。t檢驗顯著性差異：**P<0.01。

（D）1 mM L-Met對WT和AtGLR3.5-RNAi植物[Ca2+]cyt依賴的FRET效率的影響。用YC3.60的幼苗初生根進行分析。

3.AtGLR3.5功能由Met調節，Met通過Met合成酶1生物合成

在轉入萌發條件後0小時和24小時檢測了萌發種子中的Met含量。在此期間，WT中的Met含量增加了約1.6倍（圖3A）。然後，作者研究了在萌發過程中誘導AtGLR3.5介導的[Ca2+]cyt增加的Met的來源。據報導植物中的Met可以通過從頭生物合成或再循環生產。鑑於萌發是植物生命周期中最早的生理步驟，作者將重點放在生物合成上。藥理學分析表明，PAG（一種Met合成抑制劑），以劑量依賴的方式延緩發芽（圖3B）。PAG顯著地阻礙了種子胚根的伸出和萌發（圖3C，D），並且通過補充L-Met（圖3E）可以在一定程度上減輕這種損害；然而，在AtGLR3.5-RNAi種子中，這種影響要低得多。這些數據表明，Met的從頭生物合成對AtGLR3.5介導的萌發至關重要。

圖3 | 甲硫氨酸（Met）的生物合成在擬南芥種子萌發的AtGLR3.5-modualtion中起作用

（A）野生型（WT）種子在萌發條件下孵育後0小時和24小時的Met含量。

（B）不同濃度甲基生物合成抑制劑DL-丙炔甘氨酸（PAG）對野生種子萌發的影響。

（C）有或無PAG存在時WT種子的萌發表型。

（D）PAG存在或不存在時種子萌發的時間過程。種子在與（C）相同的培養基中播種，並在22°C下培養。

（E）AtGLR3.5-RNAi種子在PAG（1 mM）或PAG+Met（30μM）存在下發芽。

Met在植物中由OPH（O-磷酸高絲氨酸）通過三個連續的酶反應合成。擬南芥基因組含有三種Met合酶（AtMS）基因的功能亞型。為了確定是哪一種導致了種子萌發所需的Met的產生，作者進行了定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）分析，發現在萌發過程中AtMS1（At5g17920）的表達出現很大的變化（圖4A）。AtMS1的轉錄水平在萌發開始後24小時達到高峰，然後逐漸下降，直至萌髮結束。qRT-PCR數據表明，在萌發條件下培養24小時後，由AtMS1的2.0-kb啟動子序列驅動的表達GUS報告基因的轉基因種子的GUS活性顯著增加（圖4B）。

為了進一步評估AtMS1在發芽過程中的作用，作者分離了一個T-DNA插入突變體AtMS1，其AtMS1轉錄水平降低。在萌發條件下，Atms1突變體在0小時和24小時產生的Met量均低於WT種子（圖4C），因此表明Atms1在萌發期間Met生物合成中的作用。有趣的是，與WT（圖3A）相比，突變體中的Met含量在0 h到24 h之間下降（圖4C），這可能是由於在萌發期間消耗了大量Met和突變體中合成的Met量較低所致。突變株在24小時與0小時的Met含量之比遠低於WT（圖4D），這表明突變株有較少的Met可用於促進萌發。與此結果一致，Atms1種子的發芽率相對於WT降低（圖4E）。在外源性添加L-Met（30μM）的情況下，野生型和突變體的發芽率均增加，但在Atms1種子中的發芽率相應增加（圖4F），這意味著降低的Met水平是導致突變體發芽率降低的原因。綜合實驗相關的結果，說明了AtMS1衍生的Met在AtGLR3.5調控種子萌發中起著重要作用。

圖4 | 來自AtMS1的甲硫氨酸（Met）對擬南芥種子萌發具有正向調節作用

（A）種子萌發過程中AtMS1、AtMS2和AtMS3表達的qRT-PCR分析。

（B）AtMS1在種子胚中的表達模式由AtMS1pro::GUS指示。

（C）WT和Atms1種子中的Met含量。

（D）根據（C）中的結果，在24h與22℃下在0h的WT和Atms1種子中的Met含量之比。

（E）WT和Atms1種子的萌發。

（F）WT和Atms1種子經過或不經過L-Met處理後的萌發。

4. Met對萌發種子中AtGLR3.5和ABI4表達的差異調節

然後作者為了進一步研究Met的調節作用，檢測了它對AtGLR3.5表達的影響。如（圖5A）所示，添加L-Met上調了AtGLR3.5的表達，而Met生物合成抑制劑PAG降低了其表達。在Met含量較低的Atms1突變體中，AtGLR3.5轉錄水平顯著低於WT(圖5B)。這些數據表明，除了激活AtGLR3.5通道外，L-Met還上調了萌發種子中AtGLR3.5的表達。在之前的研究中，觀察到[Ca2+]cyt的AtGLR3.5介導增加抑制萌發種子中ABI4的表達。因此，作者研究了Met對ABI4表達的影響。結果發現L-Met降低ABI4的表達，而PAG增加其表達（圖5C）。此外，Atms1突變體中ABI4的轉錄水平比野生型高約6倍（圖5D）。總之，這些結果表明，L-Met在種子萌發過程中作用於AtGLR3.5-Ca2+-ABI4級聯的上遊，並拮抗AtGLR3.5和ABI4的功能。

圖5 | 甲硫氨酸（Met）對擬南芥AtGLR3.5和種子萌發關鍵調控因子ABI4表達的調節

（A）野生型（WT）種子經L-Met（30μM）或PAG（1 mM）處理後AtGLR3.5表達的qRT-PCR分析。

（B）AtGLR3.5在WT和Atms1種子中的表達。

（C）ABI4在WT種子中的表達對L-Met（30μM）或PAG（1 mM）的響應。

（D）ABI4在WT和Atms1種子中的表達。

研究結論

本研究中，作者證明L-Met通過上調AtGLR3.5介導的細胞溶質Ca2+信號促進擬南芥種子萌發。同時表明，L-Met對種子萌發有積極的調節作用，但這需要擬南芥AtMS1、L-Met激活AtGLR3.5Ca2+通道、調節ABI4的表達，進而促進種子萌發。

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本文運用GC-MS靶向代謝組學報導了擬南芥AtMS1（甲硫氨酸合酶1）在Met生物合成的最後一步，合成了激活AtGLR3.5 Ca2+通道所需的Met，該通道在萌發過程中表達上調，導致種子萌發的調節。作者發現外源L-Met以AtGRL3.5依賴的方式促進發芽。作者還證明了L-Met直接調節AtGLR3.5介導的幼苗胞漿Ca2+的增加。作者提供了通過AtMS1合成的Met作用於AtGLR3.5介導的Ca2+信號上遊並調節種子脫落酸反應主要調節因子ABI4表達的藥理學和遺傳學證據。總之，作者的研究結果與AtMS1、L-Met、AtGLR3.5Ca2+通道、Ca2+信號和ABI4有關，揭示了L-Met在種子萌發中的生理作用和分子機制。

參考文獻：

Chuanli Ju, Dongdong Kong, Yuree Lee, et al. Methionine Synthase 1 Provides Methionine for Activating AtGLR3.5 Ca2+ Channel and Regulating Germination in Arabidopsis[J]. Journal of Experimental Botany, 2019.

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文章來源於鹿明生物