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前言
目前，對植物中UPR活性調節和細胞死亡轉變的分子機制了解甚少。本篇為2019年8月鹿明生物合作客戶華東師範大學李小方博士團隊在Frontiers in Plant Science發表的題為「Arabidopsis GAAP1 to GAAP3 Play Redundant Role in Cell Death Inhibition by Suppressing the Upregulation of Salicylic Acid Pathway Under Endoplasmic Reticulum Stress」的研究論文，本文作者以擬南芥為研究對象運用靶向代謝組學探究GAAP1到GAAP3在細胞死亡抵抗和微調UPR激活中起著冗餘作用。GAAPs的抗細胞死亡功能可能是通過削弱ER應激下SA途徑的上調來實現的。
中文標題：擬南芥GAAP1 - GAAP3通過抑制內質網應激下水楊酸途徑的上調在細胞死亡抑制中發揮冗餘作用
研究對象：擬南芥
發表期刊：Frontiers in Plant Science
影響因子：4.106
合作單位：華東師範大學
運用生物技術：靶向代謝組學（由鹿明生物提供技術支持）、轉錄組、基因組
研究背景
植物作為固著生物，已進化出敏感的檢測系統和複雜的信號轉導機制，幫助它們應對多種脅迫條件。
其中，對於防禦反應的刺激不僅發生在局部，而且也發生在整個植物中，稱為系統獲得性抗性（SAR）。SAR途徑的激活涉及免疫信號水楊酸（SA）的細胞濃度增加。SA誘導致病相關基因（PR）和大量ER駐留基因，以確保PR蛋白的正確摺疊和分泌。SA途徑在壓力下對PCD的抵抗和促進中也起著關鍵的調節作用。然而，目前尚不清楚內質網應激誘導的細胞死亡是否與SA途徑有關。
研究思路
研究結果
1.GAAP2在幼年組織和生殖器官中優先表達
GAAP2在各種組織中表達，包括子葉、葉、根和生殖器官。在營養體發育過程中，在子葉頂端、葉原基、根尖和側根原基中發現強烈的表達信號。隨著花的發育，GUS活性在花葯和胚珠中很強，但在花瓣中沒有。
圖1 | GAAP2的表達模式
（A-G）GAAP2在營養生長期的表達模式；
（H-M）GAAP2在生殖生長期的表達模式；
GUS染色：GUS轉基因植株在2～18日齡（A）、葉尖（B）、子葉尖（C）、子葉脈（D）、葉原基和莖尖（E）、側根原基（F）和初生根尖（G）、GAAP2在整個花序（H）、花蕾9-11期（I和J）、12期（K）、14期（L）和15期（M）。
同時研究了衣黴素（TM）和脫落酸（ABA）對GAAP2基因在苗期轉錄的影響。研究表明GAAP2的表達在非生物脅迫下沒有變化。
圖2 | GAAP2轉錄水平的各種非生物脅迫影響
（A）RT-PCR法檢測50日齡植株不同組織中GAAP2的轉錄水平；
（B-C）用qRT-PCR法檢測不同脅迫處理7日齡幼苗GAAP2的轉錄水平；
2.GAAP2的突變增強了植物對內質網脅迫的敏感性
在正常生長條件下，所有突變體和轉基因植物都沒有表現出明顯的地上生長缺陷。當將幼苗轉移到含有TM（0.5μg/ml）的培養基中生長几天時，植物存活率隨著時間的增加而降低。死亡率在gaap2-1中最高，其次是gaap2-2，這與植物中GAAP2基因的水平一致。
在細胞水平上進一步分析了GAAP2對內質網應激耐受性的作用。當用0.3μg/ml TM處理gaap2突變體和補體系的幼苗48h時，分別通過臺盼藍染色和電導率測定細胞死亡和膜通透性。gaap2-1突變體的細胞顯示出最大的損傷，而gaap2-1中的gaap2-2和GAAP2顯示出與Col類似的細胞損傷。
數據表明，丟失的GAAP2增加了TM誘導的內質網應激下的細胞死亡，而GAAP2賦予內質網應激耐受性增加。
圖3 | GAAP2突變提高了幼苗對TM處理的敏感性
（A）gaap2-1和gaap2-2中T-DNA插入位點的示意圖；
（B-C）用RT-PCR（B）和qRT-PCR（C）方法檢測了GAAP2在Col、GAAP2-1、GAAP2-2和GAAP2-1轉基因植株7日齡幼苗中的表達；
（D-E）GAAP2突變增強了TM誘導的植物死亡；
3. 隨著GAAP1，GAAP2和GAAP3突變基因數量的增加，植物對ER脅迫的敏感性也增加
①GAAP1，GAAP2和GAAP3在增強植物對ER脅迫的抗性中發揮功能性冗餘作用；
②GAAP1，GAAP2和GAAP3中的突變在內質網應激下的細胞死亡抗性中起著冗餘的作用；③GAAP1和GAAP3在輕度內質網脅迫恢復期間對植物生長具有傳導作用。；
圖4 | 植株對TM處理的敏感性增加
4. GAAP1、GAAP2和GAAP3影響輕度內質網應激激活的UPR
GAAP1、GAAP2和GAAP3基因突變的幼苗比野生型和雙突變體對內質網脅迫更敏感。在內質網應激下，啟動UPR信號通路以緩解應激。GAAP1和GAAP3在急性內質網應激下對UPR的影響較小，但在輕度內質網應激開始時對UPR基因的誘導起拮抗作用。
5. GAAP1-GAAP3參與SA信號抑制細胞死亡的調控
在內質網應激下，IRE1和bZIP28可通過上調NAC089誘導PCD，NAC094和ATPase等下遊PCD相關基因的表達促進細胞死亡。研究發現，當0.3或0.5mg/ml TM作用48h時，細胞開始死亡。
為了闡明GAAPs對NAC089途徑介導的細胞死亡的影響，分析了經TM作用後24和48h NAC089及其靶基因的表達水平。gaap1gaap2gaap3 中NAC089、NAC094和ATPase基因的上調與野生型對TM處理的應答無顯著差異。DCD/NRP是指內質網應激下介導的細胞死亡。內質網應激期間，AtNRP1在AtNRP2和ANAC036下遊被激活，從而最終激活空泡處理酶VPEg誘導PCD。在TM處理期間，AtNRP1和ANAC036基因在三突變體和野生型中的表達均上調，但兩者之間的上調沒有顯著差異。數據表明GAAPs抑制PCD可能不是通過NAC089和DCD/NRP途徑介導的。
此外，SA途徑在壓力下對PCD的抗性和促進中也起著關鍵的調節作用。PR-1和PR-2是SA途徑中的關鍵靶基因。靶向代謝組學檢測顯示，TM處理後24h，三重突變體gaap1gaap2gaap3中PR-1和PR-2的表達水平明顯高於野生型和GAAP3過表達株系中的表達水平。這一發現表明內質網應激下GAAP1突變為GAAP3對PCD的促進作用可能是由SA途徑介導的。為了進一步確定SA含量是否會在ER脅迫下受到影響，對5周大的植物進行了測量，這些植物生長於22°C或用0.3μg/ml TM處理48h的SA中。結果表明，內質網應激會上調SA水平。
圖5 | GAAP1，GAAP2和GAAP3的突變增強了內質網應激下SA途徑下遊靶基因的上調
（AB）將Col，gaap1gaap2gaap3，GAAP3-OX和GAAP3-FLAG的幼苗分別用0.5μg/ml TM處理24 h，並通過qRT-PCR定量SA途徑基因的表達水平。在0h的Col中每個基因的值設定為1；
（C）內質網應激下SA的積累。從生長在22°C或用0.3μg/ml TM處理48h的5周齡植物中提取總SA並進行測量。數據來自四個生物學重複樣本（±SD）與Col植物相比，差異以星號表示（* p <0.05，** p <0.01）；
小結
本研究運用靶向代謝組學等多組學分析了GAAP2、GAAP1和GAAP3在內質網應激中的作用。雙突變體和三突變體分析表明，GAAP1-GAAP3在抑制細胞死亡和延緩內質網應激誘導的UPR活化中起著冗餘作用。UPLC-ESI-MS/MS定量檢測表明，內質網脅迫提高了植物體內SA含量。RT-PCR分析表明，在內質網應激下，GAAPs的抗細胞死亡作用可能是通過抑制SA通路的上調來實現的。
文獻參考
Wei Wang, Xin Li, Manli Zhu, et al. Arabidopsis GAAP1 to GAAP3 Play Redundant Role in Cell Death Inhibition by Suppressing the Upregulation of Salicylic Acid Pathway Under Endoplasmic Reticulum Stress[J]. Frontiers in Plant Science, 2019, 10 (Article 1032):1-13.