【代謝組學】核磁共振和質譜的優缺點—針對代謝組學研究

主要內容：

1. 核磁共振和質譜的概述

2. 核磁共振和質譜的技術比較

1.核磁共振和質譜概述

1.1 代謝組學技術概述

代謝組學分析可分為靶向分析和非靶向分析。非靶向分析側重於樣本中代謝物總量（「指紋」）的代謝譜分析。 

核磁共振通常用於代謝組學指紋圖譜研究。  

靶向代謝組學方法側重於定量和鑑定所選代謝物，例如涉及特定代謝途徑的代謝物或其他作為藥物服用或食物攝入直接產物的代謝物。在靶向代謝物分析中，通常已知正在研究的代謝物，並且可以調整樣品的製備以減少相關代謝物幹擾的影響。  

基於質譜的代謝組學方法通常是靶向分析的最佳方法。

質譜分析方法和儀器的不斷發展提供了一種高度特異的分析工具，它可以提供化學信息，如用於確定元素公式的準確質量、同位素分布模式，通過母離子和碎片離子的特性進行結構解析，利用光譜匹配法對真實化合物數據進行鑑別，並比較不同化學品在混合樣品中的濃度水平。  

與核磁共振波譜相比，質譜在分析次級代謝物方面具有優勢。此外，不同的質譜技術提供了一系列可應用的工作原理，例如不同的電離技術，因此可能增加代謝物檢測到的數量。

核磁共振波譜的高重複性以及非破壞性和非侵入性是核磁共振在代謝組學研究中的重要優勢。  

此外，核磁共振可用於體內研究，稱為磁共振波譜（MRS）；任何通過核磁共振波譜研究的體外代謝物途徑都可通過使用MRS進行體內研究。基於核磁共振的代謝組學方法涉及同位素標記的核，如13C和15N，可用於獲得有用的信息，如關於生物系統中代謝物的平衡和通過代謝途徑監測化合物的流動。  

在短短幾分鐘內即可同時檢測到大量代謝物，這進一步說明了核磁共振波譜在代謝組學研究中的優勢。例如，一個質子核磁共振譜可以量化人類尿液樣本中大約100種代謝物，這就提供了一個給定時間點人類代謝狀況的全面圖像。此外，高解析度魔角旋轉（HRMAS）核磁共振波譜可用於完整組織樣品的研究，從而無需提取等預處理步驟即可檢測組織中存在的代謝物。

沒有一個單一的分析平臺能夠對樣品中的所有分子進行完全的定量和鑑定。因此，除了一維和二維核磁共振實驗外，還需要採用不同的電離方法、液相色譜-質譜（LC-MS）和氣相色譜-質譜（GC-MS）等技術，以最大限度地鑑定複雜樣品中的不同代謝物。  

NMR、GC-MS、直接流動注射質譜（DFI/LC-MS/MS）、電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）和高效液相色譜（HPLC）的結合應用等等。

NMS vs. MS

2. 核磁共振和質譜技術比較

2.1 NMR

核磁共振波譜主要用於化學鑑定和量化給定樣品的化學成分。核磁共振波譜的應用不僅限於液體樣品，還可用於固體、氣相和組織樣品。此外，核磁共振除了在分子鑑定和結構解析中的主要應用外，還可以用來研究分子的物理化學性質，如電子密度和分子動力學。因此，核磁共振已成為結構生物學研究的主要工具，因為它使研究人員能夠在生物條件下研究分子結構和分子動力學。此外，核磁共振波譜已被廣泛應用於結構生物學、有機化學、無機化學、生物化學、物理學、生物學、高分子和藥物發現等研究領域。  

核磁共振波譜已被認為是代謝組學應用中最相關的方法之一，例如，作為一種對多種人類疾病的強有力的診斷方法。低靈敏度是核磁共振在生物醫學研究中應用的固有缺點和首要挑戰。相關機械的不斷發展，如更高的磁場強度、低溫冷卻探針和微探針，都顯著提高了核磁共振的靈敏度。動態核極化（DNP）方法是近年來發展起來的一種有效的提高核磁共振成像和光譜靈敏度的方法。

2.1.1 高分辨魔角旋轉（HRMAS）核磁共振波譜

核磁共振波譜的應用不局限於液體和固體樣品，而是通過高解析度魔角旋轉（HRMAS）核磁共振波譜擴展到完整的組織樣品。以54.74°「魔角」的角度旋轉樣品到磁場中並高速旋轉，可以獲得與溶液態核磁共振譜相當的解析度的光譜。  

使用這種方法，組織樣品的化學成分可以在不需要提取等預處理步驟的情況下自動檢測。  

在基於核磁共振的代謝組學方法中，該技術有助於提供生物流體的代謝剖面與特定組織的組織學之間的相關性。因此，HRMAS核磁共振波譜已經被用來研究包括腦、腎、肝和睪丸組織在內的小的完整組織樣品的代謝平衡。HRMAS作為鑑別典型腦膜瘤和良性組織的一種有潛力的診斷工具，近年來被廣泛應用於腦膜瘤活檢。

2.1.2 一維（1D）核磁共振波譜

儘管核磁共振波譜已被用於許多具有不同可檢測核的多維實驗，但一維質子核磁共振仍然是最有用的技術，特別是在代謝組學研究中。然而，由於化學位移的範圍很窄（10ppm），重疊信號的1H NMR譜通常會持續存在，這導致譜的比對不確定。  

圖中顯示了由正丙醇和正丁醇兩個簡單分子組成的樣品的質子核磁共振譜。從圖中可以看出，正丙醇和正丁醇的甲基的信號在0.92ppm處都是重疊信號，不能用簡單的1D核磁共振譜來分辨。此外，在1.55ppm下也獲得了重疊信號。這些重疊的信號與來自兩個分子的-CH2-基團有關，但是根據簡單的1D質子核磁共振譜，不可能將特定的信號歸因於特定的分子。

核磁共振波譜

其他原子核如碳和氮的核磁共振化學位移範圍更廣，但也帶來了其他限制。例如，一維磷（31P）核磁共振譜具有31P核天然豐度100%，化學位移範圍寬，靈敏度高等優點。因此，31P NMR譜通常被用來研究與能量代謝有關的磷脂和代謝物。然而，大多數代謝物不含磷這一事實代表了31P NMR譜的主要局限性。通常，一維碳（13C）核磁共振譜的譜寬大於200ppm，導致譜色散變寬。13C NMR波譜在分子鑑定和結構解釋方面具有特別的信息。然而，13C 核的天然豐度低（1.1%）和低靈敏度阻礙了該同位素在核磁共振代謝組學中的應用。為了增強13C NMR信號，人們開發了不同的NMR方法。例如，極化轉移無失真增強（DEPT）是提高NMR譜靈敏度的一種有效手段，利用DEPT可以將13C信號強度提高4倍。DEPT核磁共振實驗也有助於區分CH2和（CH，CH3），例如DEPT-135的13C NMR譜產生負強度的CH2峰和正強度的CH和CH3峰（下圖）。

峰圖

15NNMR譜在結構生物學中非常有用，包括蛋白質、RNA、DNA結構和動力學的研究，以及蛋白質-金屬配位、蛋白質-蛋白質和蛋白質-配體相互作用的研究。然而，由於15N的自然豐度較低，只有0.37%和較低的敏感性，這一方法在代謝組學研究中的應用前景不大。

2.1.3 二維（2D）核磁共振波譜

二維（2D）核磁共振波譜可以用來克服質子1D核磁共振波譜中重疊共振的問題，從而比1D方法能夠檢測和比對更多的代謝物。二維核磁共振波譜是基於空間自旋耦合或鍵耦合，前者主要用於結構解釋，後者用於分子鑑定。  

通過鍵相關，核磁共振譜分為兩大類：同核譜，主要是（1H-1H）如相關譜（COSY）和全相關譜（TOCSY），異核譜（1H-13C）。  

其他二維方法，如二維J分辨NMR譜（J-Res）和擴散有序譜（DOSY）已用於基於NMR的代謝組學研究。採用COSY和DOSY相結合的方法，研究了肌營養不良小鼠模型心肌組織的代謝變化。包括單量子相干（HSQC）、異核多量子關聯（HMQC）和異核多鍵關聯（HMBC）的異核二維實驗在二維上具有較高的解析度，主要使用（13C），並被用於代謝產物的識別和鑑定。

儘管二維核磁共振實驗改善了核磁共振信號的分散性，但增加的採集時間、數據大小和數據分析的複雜性，限制了這種方法的頻繁使用。然而，核磁共振儀器的不斷發展和新的更快的核磁共振信號採集和數據處理方法正導致代謝組學研究中更多地使用二維技術。

2.1.4 相關光譜學（COSY）

COSY是二維同核相關光譜的第一項技術，多年來被用於分子鑑定和結構解釋。COSY在代謝組學研究中得到了應用，因為它得益於相對較短的實驗時間，可以在幾分鐘內運行2D譜，提供的信息比從1DNMR譜獲得的信息多得多。  

最簡單的COSY脈衝序列包括一個90°RF脈衝，然後是演化時間（t1），然後是第二個90°脈衝，最後是測量周期（t2）。COSY譜主要由同核（1H-1H）相關譜組成，其中2D譜中的交叉峰通過核對之間的鍵耦合來指示。  

交叉峰是通過兩核間的鍵磁化傳遞來表示的。這為鑑定由許多分子組成的樣品中屬於同一分子的峰提供了強有力的工具，生物樣品中的代謝物也是如此。由於通過鍵關聯只發生在同一分子內，COSY核磁共振譜已被廣泛應用於基於核磁共振的代謝組學應用中。

COSY譜

上圖顯示了二維COSY核磁共振譜，耦合質子之間的相關性可用於分配核磁共振信號和識別相應的分子。然而，對於多個重疊信號，2DCOSY不夠強大，不允許分配單個信號。其他二維核磁共振實驗，如全相關譜（TOCSY），可用於輔助信號分配。

2.1.5 總相關光譜學（TCOSY）

TOCSY或HOHAHA（同核Hartmann-Hahn）是COSY的一種類似方法，其中給定核的化學位移（如H）與原子自旋系統（未斷開的耦合鏈）中相同化合物的其他Hs的化學位移相關。與COSY相似，COSY能觀察到相鄰碳原子中通過標量耦合連接的原子對（質子）之間的相互關係，TOCSY能譜不僅顯示了直接耦合的質子的交叉峰，也顯示了通過耦合鏈連接的質子的交叉峰。 

例如，如果質子A與質子B耦合，質子B與質子C耦合，COSY譜只表示A與B的耦合，而TOCSY譜則顯示A與B和C的耦合。  

下圖顯示了TOCSY（藍色）和COSY譜（紅色）的疊加圖：可以觀察到更多的藍色峰，它們代表與同一分子（正丙醇和正丁醇）相關的質子信號耦合的每個質子信號。這表明TOCSY譜可以用來分辨屬於不同分子的重疊峰。

TOCSY（藍色）和COSY譜（紅色）的疊加圖

下圖示出了上頁圖的擴展區域。很明顯，正丙醇峰可以通過簡單地檢測共享四個互相關峰（正丁醇，綠色箭頭）的信號與僅共享三個互相關峰（正丙醇，黑色箭頭）的信號進行分辨。通過在繪圖軸上繪製從交叉峰到1D光譜的投影來完成峰值的比對（下圖）。將綠色箭頭（丁醇）與3.584ppm處的信號相連的箭頭投影證實了該峰值指的是丁醇，而不是丙醇；將1.564ppm處的信號與黑色箭頭相關聯的第二個投影證實了該峰值對應於丙醇分子（下圖）。確認一個峰為丙醇，另一個峰為丁醇，就足以利用TOCSY譜完成兩個分子的所有信號比對（下圖）。1H NMR信號的分配可與其它2DNMR技術相結合，如異核相關譜。這將有助於分配其他核信號，如碳核磁共振譜。

丙醇分子

一個峰為丙醇，另一個峰為丁醇

2.1.6 異核單量子相關光譜（HSQC）

鍵關聯也可用於兩種不同類型的原子核（通常為1H，13C或15N）之間的關聯，這兩種原子核由一個鍵分離。例如，1H-13C的HSQC光譜協調了質子和相應的結合碳的化學位移，因此每對耦合原子只能獲得一個交叉峰。因此，HSQC為信號比對，特別是重疊質子信號的比對提供了一種特別有用的方法。

下圖顯示了CDCL3中正丁醇和正丙醇混合物的1H-13CHSQC光譜。結果表明，HSQC在解決重疊質子信號方面是有效的。例如，擴展區（A）在0.91ppm處分辨重疊的質子信號。此外，HSQC譜可用於質子和碳核磁共振譜的歸屬。

CDCL3中正丁醇和正丙醇混合物的1H-13C HSQC光譜

HSQC也是一種減少低靈敏度和低自然豐度原子核（如13C和15N）實驗時間的有效技術，而從較敏感的原子核I（通常1h）轉移到較不敏感的原子核（如13C和15N）的磁化強度是最重要的技術之一，在蛋白質信號比對中常用的實驗技術，由於核磁共振信號的比對是研究蛋白質結構和動力學的前提。二維多量子關聯譜（HMQC）是一種類似於HSQC譜的二維異核相關NMR方法，它提供的信息與HSQC譜相同，但使用的方法不同。HSQC和HMQC都被用於基於NMR的代謝組學研究，HSQC被認為在大分子如蛋白質方面更為優越。

異核多鍵相關（HMBC）是一種二維異核相關技術，它將兩種不同類型的原子核（即13C和1H）的化學位移聯繫起來，這些原子核被兩個或多個化學鍵分開。  

一個核的化學位移，如1H，通常在直接測量的維度（F2）中檢測到，另一個核的化學位移，如13C（X-核或異核）在間接維度中記錄，如圖所示。

化學移位示意圖

在這種方法中，使用低通濾波來消除與單鍵相互作用相對應的單鍵關聯，即所謂的「單量子相干」。例如，（1H–13C）HMBC消除了單一的C–H鍵關聯，同時將H與C的化學位移關聯起來，當H與C被兩個或三個鍵分離時，在某些情況下，甚至與更遙遠的鍵分離時。因此，（1H-13C）HMBC通常用於比對季碳和羰基化合物的信號。

HMBC與HSQC或HMQC的結合為信號的比對提供了一種強有力的方法。下圖顯示了HMQC（紅色）和HMBC（藍色），七個紅色交叉峰與正丙醇和正丁醇中的七個碳有關，十六個藍色交叉峰與長鍵相關相互作用有關。該圖展示了結合和整合二維核磁共振實驗信息進行光譜分配的能力。HMQC譜可用於區分重疊信號和分離信號。

例如，在0.92ppm左右觀察到的質子多重波信號與10.07和13.79ppm處的兩個碳峰相耦合，證實質子核磁共振信號確實是兩個重疊的信號。類似地，約1.55ppm的質子倍增與兩個碳信號耦合，而1.37、3.54和3.58ppm的剩餘質子信號中的每一個僅與一個碳信號耦合。

HMBC與HSQC或HMQC的結合示意圖

此外，HMBC和HSQC光譜可用於正丁醇和正丙醇的分離和分配。例如，連接25.67ppm的碳信號和1.564的質子共振的碳HSQC交叉峰（紅色）與兩個HMBC交叉峰（黑色箭頭）對齊，因此，將三個峰分配給正丙醇分子，而HSQC（紅色）與另外三個藍色HMBC交叉峰對齊，將這些峰分配給正丁醇分子（綠色箭頭；見下圖）。

下圖展示了正丁醇化學鍵連接的示例模型，該模型可以通過二維實驗對同核關聯和異核關聯進行研究。

2.2 質譜（MS）

質譜（MS）是主要用於鑑定未知化合物和量化樣品中的已知分子。至於核磁共振和X射線，它也可用於結構解釋和研究所研究材料的化學性質。由於其高靈敏度和高選擇性，為生物樣品等混合樣品中代謝物的分析提供了重要的分析平臺。此外，質譜還可以檢測不含質子或碳的離子，如金屬離子。然而，沒有一種MS方法適合於檢測所有種類的代謝產物，因此必須使用一種以上的方法進行全面的代謝譜分析。

質譜儀具有不同的電離源和可用於檢測不同種類分子的質譜分析儀。例如，使用GC-MS的優點包括高分離效率和可重複的保留時間，可在不同實驗室之間交換，以使用保留時間作為標記的保留指數概念進行數據比較。  

然而，GC-MS固有的局限性在於它只檢測揮發性化合物或可衍生成揮發性的化合物。

此外，MS不能檢測到所有的代謝物，因為有些代謝物不能用某些電離方法電離。  

MS檢測器的動態範圍仍然只有3-4個數量級，而代謝產物濃度的動態範圍通常要大得多，沒有一種檢測器能夠檢測出所有的代謝產物。在生物樣品的代謝驗證中，一個普遍的挑戰是許多代謝物尚未完全鑑定。

主要流程示意圖

質譜法能檢測到的代謝物的數量和種類取決於電離模式的選擇。沒有一種單一的電離方法可以涵蓋所有的代謝物類別，如極性、非極性中性和離子性。因此，應獨立使用不同的電離方法，以最大限度地增加檢測到的代謝物數量。  

例如，在LC-MS分析中，正模式的電噴霧電離（ESI）是最常見的模式，可以有效地電離大範圍的中型極性分子，而負電離模式對於某些代謝物類別（如碳水化合物和有機酸）更為強大。  

據報導，大氣壓化學電離（APCI）和電噴霧電離（ESI）都能使紅細胞代謝組的覆蓋率增加34%。 

據報導，通過使用一套不同的GC-MS和LC-MS互補方法，可在血液樣本的定向分析方法中檢測多達100–500種代謝物，並可在指紋模式中檢測約600–1000種代謝物。  

需要注意的是，LC-MS和GC-MS中的代謝產物鑑定策略不同，通常只檢測分子離子，需要額外的MS/MS實驗來獲得代謝產物的特性和結構信息。

2.2.1 液相色譜-質譜（LC-MS）

LC-MS包括兩種強大的分析工具：高效液相色譜法（高效液相色譜法，簡稱高壓液相色譜法）和質譜法。當組合時，LC-MS用於分離、鑑定和定量混合樣品中的分子。  

高效液相色譜技術首先根據分子大小、電荷、極性和對其他分子的依附性等不同的物理和化學性質來分離分子。至於其他色譜技術，高效液相色譜由固定相和流動相組成。  

固定相包括使用矽膠等材料，這些材料根據分子大小在不同程度上減緩分子的移動，從而允許根據大小差異分離分子。  

流動相包括含有樣品混合物的溶液，並通過分子分離發生的固定相（色譜柱）。  

柱層析法可用於從混合物中純化單個化合物。不同的樣品需要不同的色譜柱、蛋白質和肽樣品，例如，需要不同的色譜柱，不同於代謝組學研究中典型的小分子樣品所需的色譜柱。一旦分析物被分離，它們就會通過質譜分析儀，在那裡根據質荷比進行檢測，每條合成線的強度對應於每個分子的相對濃度。

液相色譜-質譜聯用技術以其分離和檢測多種分子的能力，可能是應用最廣泛的質譜技術，特別是在生物科學中。LC-MS是進行大多數代謝物分析研究的一種非常適用的工具，可以獲得高靈敏度的定量和結構信息。不同的分離方法可以用來分離不同種類的代謝物。  

反相梯度色譜法（RP）已成為LC-MS研究中最常用的用於全局代謝產物分析的分離方法。然而，這不是極性和/或離子物種的最合適方法，其中包括許多重要的代謝物（有機酸或胺基酸）。這些代謝物是生化途徑中非常重要的組成部分，它們的評價可能對檢測關鍵代謝狀態，如先天性代謝錯誤和代謝症候群有重要意義。

親水相互作用色譜法（HILIC）是一種可用於極性代謝物離子化的方法，可增加代謝物檢測的廣度。為了最大限度地覆蓋代謝物，可以對樣品進行兩次分析，要麼分別使用RP和HILIC，要麼在HILIC和RP-LC的「正交」組合中使用二維分析的柱切換方法。儘管RP和HILIC聯合使用是許多代謝物的首選電離方法，但這種方法並不涵蓋生物樣品（如尿液）代謝物極性的整個範圍。  

因此，建議採用其他電離方法，如正、負電噴霧電離（ESI）模式和大氣壓化學電離（APCI），以便最大限度地檢測生物樣品中的不同代謝物。考慮到所有這些可能性，需要以八種不同模式（八次獨立運行）進行分析，以全面分析代謝物。這些組合拓寬了LC-MS在代謝組學中的應用，事實上，無論是靶向代謝組學分析還是非靶向代謝組學分析，都越來越多地使用不同的LC-MS方法進行。

2.2.2  氣相色譜-質譜 GC-MS

GC-MS是一種新的分析揮發性分子的工具，由於現代毛細管氣相色譜具有高解析度和可重複性的色譜分離，這些特點使其非常適合複雜代謝混合物的分析。與LC-MS類似，GC-MS由氣相色譜和質譜兩種強大的分析方法組成。這些方法共同提供了一種最強大的分離方法，可用於提供揮發性化合物的定性和定量信息。  

樣品首先通過氣相色譜儀，在氣相色譜儀中對混合物中的揮發性有機化合物進行高解析度分離。氣相色譜裝置主要由色譜柱組成，基本上是一個長度從小於2米到60米或以上不等的管，直徑從10釐米到30釐米不等。

不同類型的色譜柱，如填充柱和毛細管柱，用於分離不同類型的樣品。填充管可以是不鏽鋼、玻璃或熔融石英製成，通常以線圈的形式形成，以便在大約250℃的溫度下放入高溫實驗用的烘箱中。惰性氣體（如氦氣）吹過色譜柱；當樣品進入色譜柱時，它蒸發了，揮發性分子被氦推動穿過柱。一開始，所有的分子一起移動，但根據分子量和大小，其中某些分子的移動速度比其他分子慢。較小的分子比較大的分子移動得更快，當它們通過色譜柱時，分子繼續彼此分離，最終以不同的組分形式從色譜柱中出現，從而提供了一種有效的分離方法。

當分子離開氣相色譜柱時，它們被引入質譜，在那裡用電離方法（如電子束）電離。由特定分子形成的離子將取決於該分子的性質，並且該分子的電離分子和離子片段都可用於根據質荷比在分子水平上區分和識別混合物的組分。此外，可以通過測量峰的絕對強度來獲得關於混合物成分的定性信息，其中最高峰被取為表示100%豐度，並用作其他峰的參考。  

因此，GC-MS是分析揮發性代謝物的首選分析工具，已被用於代謝組學研究的不同領域，包括植物代謝組學和篩選先天代謝錯誤。

除了建立良好的資料庫，如費恩（Fiehn）代謝組學庫，GC-MS提供了良好的重現性和高度可重複的片段，因此為鑑定代謝物提供了有力的工具。其他優點包括高靈敏度和解析度、低成本和易於使用的儀器。氣相色譜-質譜分析的主要局限性在於僅限於小分子揮發性物質，這意味著該方法在全球代謝譜研究中的應用有限。  

氣相色譜-質譜分析的主要局限性在於僅限於小分子揮發性物質，這意味著該方法在全球代謝譜研究中的應用有限。再者，生物樣品的製備，如生物體液，可能會耗費時間和重複性，這可能會導致實驗誤差。在電離過程中，可能會出現其他問題，如產物的形成和降解。此外，在衍生化反應中，非揮發性代謝物可以轉化為不同形式的衍生物，產生碎片，從而使同一母體代謝物的不同形式共存。在分析代謝物含量具有高度可變性的真實樣品（如人類尿液）時，根據代謝物的不同性質，衍生化可能以不同的轉化率發生，因此潛在地顯著影響再現性和總體結果。為了克服諸如不精確量化的問題，標準化合物可用於衍生標準化合物和數據校正過程，例如標準化。

為了產生可重複的質譜和高度可轉移的EI-MS譜庫，建議使用70ev的標準MS電子電離能，以便通過質譜庫匹配（如NIST和FiehnLib）識別化合物。