賽默飛:病毒感染中基於代謝及脂質組學的亮點研究成果

儀器信息網訊 2020年，新型冠狀病毒肺炎在中國和國際的迅速傳播引發了全球衛生緊急情況。儀器信息網在密切關注疫情發展態勢的同時，也更加關注病毒感染的致病機理等相關研究進展。近年來，組學研究成為生命科學基礎研究領域的重點，對於病理、毒理學、藥物動力學等具有重要價值，相關高水平學術期刊大量報導了科研人員利用組學技術開展的病毒致病病理學的研究成果，也對於此次疫情的進一步研究具有一定參考意義。

基於此，儀器信息網推出了「組學技術在病毒感染致病機制中的亮點研究及技術進展」專題，為廣大業內專家及用戶介紹基於蛋白組學或代謝組學等多組學技術在病毒感染致病機制中的研究應用及技術進展，增強業界專家與儀器企業之間的信息交流，提供更豐富、更專業的技術文章，謹以此致敬所有奮戰在抗疫一線的白衣天使以及幕後深耕的研究學者。

新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）感染的新型肺炎（COVID-19）疫情正在全世界範圍內持續蔓延，引發的感染人數不斷增加。截止到目前，全球感染人數已近300萬，每天新增報告人數超過8萬。由此疫情引發的社會影響不但擴大，讓人們再一次感受到傳染性病毒研究的緊迫性。

科研界已有大量研究論文對SARS-CoV-2 病毒基因結構特點，COVID-19的流行病學和臨床特徵進行了較為系統性的研究。然而，SARS-CoV-2 病毒進入人體後，如何引起體內代謝水平的變化，以及這些變化如何影響患者及預後水平尚未可知。代謝組學和脂質組學技術作為精準醫療研究的重要組成部分，在中東呼吸症候群，伊波拉病毒，SARS-Cov-2等病毒研究中體現出重要價值，幫助研究人員確定病毒侵染宿主後代謝物的變化，闡明致病潛在機制、尋找診斷生物標誌物，以及疾病分期分型等^[1]。

因此，採用代謝組學和脂質組學技術研究SARS-CoV-2對機體系統的損害及其潛在機制，可以幫助研究人員更快的發現藥物靶點，開發診斷和預後評價生物標誌物，以便及時診斷，有效地治療COVID-19患者，並降低死亡率。本文中將對病毒感染中基於代謝組學和脂質組學的代表性研究成果和進展做簡要的介紹。

1.   基於Orbitrap的多組學技術研究新冠肺炎輕重症患者分型和生物標誌物

根據新冠狀病毒感染的肺炎診斷和治療計劃，患有合併症的老年人更容易感染SARS-CoV-2，尤其是那些患有高血壓，冠心病或糖尿病的人。 此外，CVD患者如果感染SARS-CoV-2，則更有可能出現嚴重症狀^[2]。另據世界衛生組織調查，新冠肺炎患者大約80%患者症狀較輕，14%左右發展為嚴重疾病，5%左右屬於重症病例，其中，重症患者的死亡率超過50%。

在臨床治療中，為什麼輕症患者會在短時間內迅速演變為重症成為急需解決的難題之一。國內西湖大學生命科學學院郭天南教授與合作團隊，採用Q Exactive HF-X和 Q Exactive HF質譜分別對新冠肺炎患者血液中的蛋白質，代謝物和脂質進行系統考察，研究結果以預印本形式發表在2020年4月在medRxiv雜誌上^[3]。

研究人員發現，新冠肺炎重症患者的樣本中出現了93種特有的蛋白表達和204個特徵性改變的代謝分子。這些變化中，可以發現100多種代謝物和100多種脂質均出現顯著下調，而21-羥基孕烯醇酮增加，犬尿氨酸通路被激活；鞘脂，膽鹼，甘油磷脂等脂類分子降低顯著。這些代謝物的變化與患者體內的巨噬細胞、補體系統、血小板脫顆粒有關。並通過機器學習分析方法，整合蛋白質組、臨床、生物、代謝組、計算等多學科數據篩選出重症患者特徵性的22個蛋白質和7個代謝物。這些體內分子水平的變化，為臨床疾病分型，重症病人的早期診斷，以及治療手段提供理論依據，有望為預測輕症患者向重症發展提供導向。

圖1a: 新冠肺炎輕重症患者差異性蛋白，代謝物，脂質

圖1b:機器學習預測重症患者

2. 基於Q Exactive代謝組學技術研究免疫應答的過程

目前全球共有數十個科研團隊在加緊進行針對新冠病毒的疫苗研發工作，中國和美國已經有一些項目進入臨床試驗，期望更早一步將研究成果應用到健康人身上。根據臨床經驗，疫苗雖然可以預防許多疾病，但不同人群接種同一種疫苗後，所產生的免疫反應和預防效果也有很大的不同。2017年發表在Cell 雜誌的一項研究表明[4]，小分子代謝物對免疫細胞的增殖分化及其功能息息相關。整合轉錄組學和代謝組學研究顯示，代謝反應是人類對帶狀皰疹病毒疫苗的免疫反應有效性的基礎。

圖2:接種疫苗後，體內免疫應答過程

研究人員開展了病毒疫苗接種在健康成人上的縱向研究，分別收集接種前和接種後的血液進行轉錄組學和代謝組學分析。研究結果顯示，接種疫苗後第1天起，嘌呤代謝，亞油酸代謝、蛋氨酸和半胱氨酸代謝、甘油磷脂代謝和糖磷脂代謝等於轉錄組學密切相關。並構建MMRN網絡，結合接種者年齡、性別和病毒載量相關的網絡來預測有效性，揭示甾醇代謝基因和代謝物之間的聯繫，而磷酸肌醇代謝提供了代謝表型，影響免疫結果。

通過此項研究，可以幫助研究人員對疫苗接種的免疫反應進行情境分析，確定影響療效的相關因素，同時為免疫反應提供新的生物學見解，促進未來的生物標記物研究和疫苗開發。

3.機制研究助力廣譜抗病毒藥物的研發

SARS-CoV-2 病毒引起的嚴重疫情的主要原因，除了和病毒本身傳播力強有關之外，也與尚未有獲得批准的特定藥物或疫苗因素有關。而全球醫療體系在冠狀病毒治療藥物方面還處於非常被動的層面。採用組學技術研究病毒侵染人體後，機體代謝水平的變化及其機制的研究，可以發現病毒侵染人體的代謝通路。為發現抗病毒新藥靶點，以及廣譜抗病毒藥物的研發提供依據。

病毒在侵染機體的過程中，需要利用宿主的新陳代謝，通過重構宿主的代謝途徑進行複製。核苷酸，蛋白質和脂質合成是病毒侵染宿主的主要物質基礎。研究人員通過培養SARS-CoV-2感染的組織細胞，雪貂和COVID-19已故病人樣本表明，病毒感染會顯著抑制NAD代謝組，雪貂和人類的SARS-CoV-2感染下調了色氨酸和煙酸（NA）的NAD合成，同時上調了煙醯胺（NAM）和煙醯胺核苷（NR）的合成能力，這可能會給細胞帶來巨大壓力。基因表達和藥理學數據表明，通過煙考醯胺和煙醯胺核糖苷激酶途徑增強NAD +可能恢復抗病毒PARP功能以支持對SARS-CoV-2的先天免疫[5]。這一研究成果與西湖大學研究團隊不同，可能與選擇的模型和疾病所處的分期有關。

圖3: SARS-CoV-2 感染後體內NAD+等代謝變化

 Nils C. Gassen等對SARS-CoV-2控制的自噬的分析表明，亞精胺，MK-2206和煙醯胺可能是潛在有效的抗病毒藥物。既有研究顯示，基於自噬等新陳代謝相關的方法顯著降低了高致病性中東呼吸症候群（MERS）-CoV的傳播。

圖4: SARS-CoV-2 影響的主要代謝通路

研究人員發現，SARS-CoV-2感染通過幹擾多種代謝途徑來限制自噬，採用化合物幹預手段來幹預自噬過程，可降低SARS-CoV-2 在體外的傳播。自噬信號傳導和代謝組學技術深入分析表明，SARS-28 CoV-2通過限制AMP蛋白激活激酶（AMPK）和雷帕黴素複合物1（mTORC1）的激活來減少糖酵解和蛋白翻譯，減少自噬。病毒感染會下調自噬誘導的亞精胺合成，促進自噬引發的Beclin-1（BECN1）的AKT1 / SKP2依賴性降解。 通過外源給予亞精胺，AKT抑制劑MK-2206，Beclin-1穩定劑，煙醯胺可抑制SARS-CoV-2的傳播^[6]。

4.賽默飛代謝組學和脂質組學技術方案

由於代謝組學樣本的高度複雜性和代謝物的特徵，研究者在病毒研究中遇到了諸多的挑戰，特別是提高代謝物組覆蓋率，更高的靈敏度訴求、大隊列研究中的穩定性和重現性，代謝物鑑定等方面一直制約著代謝組學學科的發展。要想獲得高質量、高準確度的分析結果，對平臺技術的建設和提升無疑也是極為重要的。

賽默飛作為生命科學儀器領域的領導者，致力於幫助科研人員收穫代謝組學和脂質組學技術在病毒研究中的作用，深度探究病毒侵染宿主的代謝分子變化機制，加速生物標誌物和抗病毒藥物的發現。我們已在色譜分離、質譜檢測與生物信息軟體等方向構建了非常有特色的完整解決方案。

解決方案包含四部分：（1）推薦的樣品製備方法；（2）不同色譜分離手段：如LC（親水性的HILIC、疏水性的C30和常規C18）、GC和離子色譜構成；（3）質譜檢測平臺：由定性定量的Orbitrap平臺（Q Exactive 系列、Exploris 480，Fusion系列），以及三重四級杆系列（TSQ Altis、Quantis）構成；（4）數據處理平臺：由側重非靶標代謝組學和代謝流的Compound Discoverer軟體、脂質組學軟體LipidSearch，以及大規模代謝物靶向定量的TraceFinder軟體組成。

圖5：賽默飛代謝組學解決方案

4.1 特色解決方案1：離子色譜解決極性大代謝物分析難題

作為病毒侵染宿主重要的物質，糖酵解途徑代謝產物、三羧酸循環代謝產物，NAD+以及核苷酸代謝物，因其重要的生物學功能，在代謝組學研究中越來越受到重視。以往這類化合物的檢測，研究者多採用GC-MS技術，但由於這些代謝物的極性強、揮發性低，往往需要進行衍生化處理，大大增加研究者的工作量和數據挖掘過程中的不確定性。離子色譜作為液相色譜的一種，對糖類、胺基酸、核酸、有機酸等物質的分析起著重要的作用^[7]。

圖6：糖酵解途徑中單磷酸糖類離子色譜研究

4.2 特色解決方案2：穩定同位素標記技術（代謝流組學）

傳統代謝組學分析的結果不能提供有關細胞內代謝率和代謝途徑活性的信息^[8]。例如，豐度的變化提高可能來源於上遊物質產量的增加，但也可能來自於下遊物質消耗量的減少。同時應注意的是，生物體內的代謝物來源可能存在多條路徑，因此代謝物豐度的變化也可能來源於已知或未知的代謝通路。因此，單純從代謝物豐度變化的顯著程度來解釋疾病發生發展的過程，存在很大的不確定性。

確定代謝物在代謝途徑中的作用的最有希望的方法之一是「穩定同位素」示蹤劑跟蹤其去向^[8]。通過穩定同位素標記的葡萄糖或穀氨醯胺（含有 13C、15N），檢測下遊代謝物的穩定同位素標記的狀態，代謝流量等參數，深度挖掘代謝物的精確流向，可提供相關代謝物在某一流路的動態變化信息。這項技術已成為近年來的研究熱點技術之一，在腫瘤、糖尿病等疾病機制研究中大放異彩。

多項研究表明，儀器的質量解析度在代謝流研究中起著非常重要的作用^[8-9]。足夠高的解析度和質量精度可以排除背景離子幹擾，從而在未知代謝物發現和代謝途徑方面獲得更好的結果。Demo實驗室採用含有穩定同位素標記的 13C6葡萄糖和^[13] C5 ^[15] N2穀氨醯胺培養基中培養MDB-MA-231細胞， 24小時後檢測樣品中三磷酸腺苷（ATP）含量的變化。 隨著儀器上的MS解析度增加，同位素峰變得更加明確，13C和15N雙標記的同位素代謝物在更高解析度下得到基線分離。結果表明，高解析度和穩定的質量準確度是準確分別同位素標記代謝物的重要因素，幫助更準確的示蹤複雜樣品中的代謝物同位素，確認代謝途徑。

 

圖7：超高解析度在區分ATP精細同位素上的重要性

4.3 特色解決方案3：脂質組學

我們看到在新冠病毒肺炎研究中，脂類發生了非常顯著的變化。脂質組學作為一門新興的研究學科，其成果對科學家深入理解細胞生理和病理過程十分重要。作為代謝組學的重要分支，脂質組學在研究細胞凋亡、信號傳導、疾病感染、免疫功能、新生兒代謝缺陷等方面起著重要的作用^[9]。脂類化合物的代謝還與糖尿病、肝癌、腎病、乳腺癌密切相關^[10-12]。「十三五」重大項目指南，國家自然科學基金委員會等重大項目指南中，均把脂質研究列為重點研究專項，期望通過特異性脂質生物標記物的分析，我們有希望區分健康人群與患病風險人群，進行疾病早期診斷，為脂代謝紊亂疾病的預防和治療提供理論基礎 ^[10]。

賽默飛和業內科學家緊密合作，在脂質組學應用中開發了完整的靶標和非靶標脂質組學分析流程，配合LipidSearch 專業脂質組學數據處理軟體，可以快速實現脂質分子的自動鑑定和相對定量。

圖8：賽默飛脂質組學方案

我們期望通過全球各個國家和各個行業的共同協作，在攻克新型病毒上努力行動。作為賽默飛的成員，希望通過本文基於Orbitrap的多組學技術在SARS-CoV-2 研究進展的梳理，幫助一線的醫務工作者和科研人員更好的發力，早日戰勝這場疫情。謹以此文致敬白衣天使和深耕醫學研究的學者。

參考文獻：

1.  Beger R D , Dunn W , Schmidt M A , et al. Metabolomics enables precision medicine: 「A White Paper, Community Perspective」[J]. Metabolomics, 2016, 12(9):149.

2.  Zheng YY, Ma YT, Zhang JY, Xie X. Nat Rev Cardiol. COVID-19 and the cardiovascular system. 2020 May;17(5):259-260. doi: 10.1038/s41569-020-0360-5.

3.  Proteomic and Metabolomic Characterization of COVID-19 Patient Sera.https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.04.07.20054585v1

4.  Li S, Sullivan NL, Rouphael N, et al. Metabolic Phenotypes of Response to Vaccination in Humans. Cell. 2017;169(5):862–877.e17. doi:10.1016/j.cell.2017.04.026

5.  Coronavirus Infection and PARP Expression Dysregulate the NAD Metabolome: A Potentially Actionable Component of Innate Immunity

6.  N. C. Gassen et al., SKP2 attenuates autophagy through Beclin1-ubiquitination and its 235 inhibition reduces MERS-Coronavirus infection. Nat Commun 10, 5770 (2019).

7.  Wang J, Christison TT, Misuno K, et al. Metabolomic profiling of anionic metabolites in head and neck cancer cells by capillary ion chromatography with Orbitrap mass spectrometry. Anal Chem. 2014;86(10):5116-24

8.  Johnson CH, Ivanisevic J, Siuzdak G. Metabolomics: beyond biomarkers and towards mechanisms. Nat Rev Mol Cell Biol. 2016;17(7):451-9

9.  Vaz FM, Pras-Raves M, Bootsma AH, van Kampen AH. Principles and practice of lipidomics. J Inherit Metab Dis. 2015;38(1):41-52

10.  劉虎威,白玉.脂質組學及其分析方法[J].色譜,2017,35(01):86-90.

11. Jiang Y, Sun A, Zhao Y, et al. Proteomics identifies new therapeutic targets of early-stage hepatocellular carcinoma. Nature. 2019;567(7747):257-261

12.  Garcia-Bermudez J, Baudrier L, Bayraktar EC, et al. Squalene accumulation in cholesterol auxotrophic lymphomas prevents oxidative cell death. Nature. 2019;567(7746):118-122

投稿來源：賽默飛色譜與質譜