揭秘：16年前的血漿樣本還能做代謝組學研究嗎？

樣本放太久，想做代謝組學研究怎麼辦？如果您有同樣的疑惑，請看下面的文章。

研究背景

臨床上研究代謝組學最常用的樣本就是血漿和血清，嚴格的quality assurance，quality control才會保證最終分析結果的可靠性。樣本採集，處理，運輸及保存都直接影響樣本中代謝物的穩定性。臨床上，對於生物樣本的保存最常用的方法就是液氮保存與低溫冰箱（通常是-80℃）保存。然而就安全性與經濟性來說，生物樣本的長期保存尤其是生物樣本庫建庫更多傾向於-80℃低溫保存。因此，對於長期保存在-80℃低溫冰箱中的血漿或血清樣本來說，代謝物的穩定性及樣本質量與保存時間長短的關係需要進一步分析探究。

研究路線

作者招募了3個年齡組的志願者採集血漿樣本，為了減少受試者個體間的差異性對實驗結果的幹擾，每個受試者都是多次取樣。在同一年齡組內，作者分析了不同保存時間段內代謝物含量變化，從而得到stable metabolites和unstable metabolites的種類。然後作者用box plots對selected plasma metabolites的血漿含量進行分析，並用MxP Biofluids Quality Control assay對sample quality進行評估，分析得到long-term storage對血漿樣本代謝組的影響。

研究結果

1.長期保存會影響血漿樣本代謝組

作者對3個年齡組的血漿樣本代謝物含量按保存時間長短進行比較分析發現，檢測到的231種代謝物中，有226種在保存時間的前七年中保持穩定；保存11年的樣本相比於保存9年的樣本，26%的代謝物含量發生了變化（20%的代謝物含量升高，6%的代謝物含量降低）；保存16年的樣本相較於保存14年的樣本，7%的代謝物含量發生了顯著變化，另外有6%代謝物含量發生了降低。雖然大多數類別的代謝物含量都或多或少受到長期保存的影響，但是complex lipids，fatty acids，energy metabolism molecules，amino acids及相關的化合物則表現出對長期保存 highest sensitivity。人血漿代謝組在低於7年保存時間時足夠的穩定，但是對更長的保存時間比較敏感。

2.長期保存對血漿代謝物含量的影響

Box plots對選定的部分代謝物含量變化進行分析（紅色是70歲組，藍色是75歲組，綠色是80歲組）

可以看到，長期保存後，精氨酸和甘油酸酯濃度明顯上升；天冬氨酸濃度上升，而天冬醯胺濃度下降，表現為天冬氨酸與天冬醯胺比例上調；丙酮酸，半胱氨酸和胱氨酸的濃度下降。

在同一年齡組內，長期保存後，多種溶血磷脂醯膽鹼，C 18:2, C 18:1, C 18:0, C 24:0均表現出濃度增加，但是數種磷脂醯膽鹼尤其是包含不飽和鍵的C 20:5, C 20:4濃度減少。

幾種脂質氫過氧化物，甘油三酯（TAG）氫過氧化物和膽甾醇酯氫過氧化物都表現出隨保存時間延長而濃度增加。值得一提的是，在同一年齡組內，大多數保存超過七年的血漿樣本中脂質氫過氧化物濃度顯著增加。

3.長期保存影響樣本質量

為了進一步驗證代謝物濃度的差異與長期保存相關，作者使用MxP Biofluids Quality Control assay對樣本質量進行評價。

幾乎所有的樣本都有很高的MxP Blood Processing Control Score，表示高質量的血液樣本收集和處理；相比之下，作者發現，MxP Blood Processing Control Score隨著樣本保存時間的延長下降，例如，97%的保存時間少於四年的樣本顯示出high-quality score，而100%的保存時間介於14年與16年之間的樣本顯示出low-quality score。這些結果顯示，延長-80℃保存時間影響樣本質量，代謝物的濃度變化與保存時間有關，而非樣本處理。雖然記錄顯示，EDTA血漿樣本一直保存在-80℃環境中，但是quality score的普遍下降也可能是因為保存與運輸過程中溫度上升，以及血液和血漿樣本處理時間過長。

研究結論

用標準化的方法收集處理樣本是弱化及排除confounding factors的影響，從而實現bench to bedside轉化研究目標的關鍵。我們已經證實，長期保存主要影響人血漿樣本中代謝物的穩定性，從而影響代謝組學研究的數據分析。在這種背景下，研究結果顯示，代謝物分析適合於在數據分析之前對低質量樣本的鑑定。雖然當保存時間在7年內，幾乎所有被檢測的代謝物在-80℃環境中很穩定，但是基於冰凍樣本的biomarker研究最好還是在採樣後儘快進行。

武漢邁特維爾生物科技有限公司（簡稱「邁維代謝」）位於武漢國家生物產業基地--光谷生物城，專注於提供領先的代謝組學技術開發及服務。邁維代謝創新了「廣泛靶向代謝組」技術，基於「代謝組+基因組+轉錄組」多組學研究方案，近年來以通訊作者身份在Cell、Nature Communications 、Nature Genetics 、PNAS等國際學術期刊發表多篇論文，引領基因組時代的代謝生物學研究新方向。