千裡之行，始於足下！樣本的正確收集以及預處理是實驗成功的重要起點，鹿明生物具有多年代謝組學分析經驗，給您帶來生物樣本收集以及預處理經驗的乾貨分享。
取樣基本原則
代表性和一致性
實驗組與對照組樣本在取材部位、時間處理等方面儘可能保持一致，從而保證實驗的可信度；
迅速性
操作過程迅速，最大限度縮短樣本採集到實驗的時間；
低溫原則
所有樣本離體後，分離步驟應在4℃或冰上進行，分離好的樣本立即存於-80℃，以免樣本產生進一步代謝活動；
血液樣本收集指南
血清：
1）用促凝管（沒有促凝管則用離心管）收集血液，將促凝管/離心管直立、靜置於試管架上，避免振蕩、摔落；
2）避免陽光直射，室溫；
3）檢查凝血完全後，2500 ~ 3000 rpm，4℃ 低速離心5 min，吸取200 µL上清液至1.5 mL離心管中，若上清液較多可每管200 µL、多管分裝，於-80 ℃凍存待用；
4）嚴禁反覆凍融，如發生溶血則該樣本不合格、需重新準備樣本。合格樣本用乾冰運輸。
血漿：
1）用抗凝管採血，採血後立刻輕柔上下顛倒8次，使抗凝劑與血液均勻混合（動作輕柔，以避免產生溶血）；
2）2500 ~ 3000 rpm，4 ℃低速離心5 min，吸取200 µL上清液分裝至1.5mL離心管中，-80 ℃凍存待用；
3）血液樣本採集後應立即把血漿從全血中分離出來，最晚不遲於採血後1 h內分離出血漿。合格樣本用乾冰運輸。
溫馨提示：
（1）試管的使用
涉及到RNA等的多組學實驗取樣，請勿使用肝素鈉抗凝管（對 RNA 相關實驗有嚴重影響，抑制反轉錄酶活性而導致cDNA量不足）；
核磁實驗（NMR）請勿使用EDTA抗凝管（影響圖譜採譜）；
代謝實驗取樣不建議使用檸檬酸鈉抗凝管（檸檬酸是TCA循環中的重要物質，使用檸檬酸鈉抗凝劑會引入外源汙染），請根據實驗具體情況選用合適的抗凝管。
（2）影響因素
取血時如用酒精消毒，請擦乾擦拭部位，待酒精完全揮發後再取樣；
取血時如有使用麻醉劑，建議用異氟醚消毒，以避免在譜圖中出現幹擾峰。
（3）產率
血清參考產率：30% ~ 50%（例如：1 mL 全血大約能得 0.3 ~ 0.5 mL 血清）。
血漿參考產率：≈ 50 %（例如：1 mL全血大約能得 0.5 mL 血漿）。
採全血時如使用真空採血管，建議使用促凝管。
（4）凍存管的使用
強烈推薦收集儘量多的樣本並分裝凍存（同批次樣本可以用於多項實驗，且避免反覆凍融而導致結果不理想），分裝保存時推薦使用1.5 mL離心管，因為螺口凍存管帽內有一個密封用的橡膠墊圈，長期在-80 ℃/乾冰等低溫下，橡膠圈會變硬脆、易脫落，導致管口密封不嚴，樣本滲露。
糞便樣本收集指南
人糞便：
1）將糞便直接排洩到乾淨的容器中，儘量避免尿液、馬桶壁等對糞便樣本的汙染，取同時間段樣本或將所有樣本混勻後再取樣；
2）用無菌勺對糞便樣本進行挖取，將適量糞便樣本放入無菌保存管中，分裝樣本200 mg/管，迅速放入液氮中15min以上進行淬滅處理；
3）採集好的樣本立刻放入-80 ℃保存待用。
小鼠/大鼠糞便：
1）將待取的小鼠/大鼠放進乾淨的鋪有消毒濾紙的籠子裡，排便後立即用無菌鑷子轉入凍存管；
2）小鼠糞便6-8粒，大鼠糞便2-3粒；
3）若樣本需要重複檢測，可用無菌棒混勻後多管分裝，以避免反覆凍融，樣本採集後立刻放入-80℃保存待用。
溫馨提示：
1.糞便樣本儘量不要接觸到尿液，避免多樣本交叉汙染，且尿液中含有大量尿素，幹擾後續糞便樣本檢測。
2.糞便樣本收集之後，建議先放入液氮中淬滅15 min後，再放入-80 ℃凍存。
3.建議統一糞便樣本形態（如固態、液態（糞水）、凍幹糞便等）
4.人糞便樣本提供者在取樣的近三個月內不可接受抗生素治療。
尿液樣本收集指南
尿液：
1）取空腹晨尿、中段尿（臨床）或晨間1 h尿（動物）於50 mL離心管中；
2）4 ℃ 下10000 rpm離心10 min取上清，用1.5 mL離心管分裝，保存於-80 ℃。
3）動物1 h尿量不夠的情況下，可分多次收集尿液；如需收取24 h尿液，需要使用帶低溫裝置的代謝籠收集，並且及時凍存樣本。
4）收集完尿液樣本後，建議使用液氮淬滅15 min後，再分裝多管後於-80 ℃凍存。
組織樣本收集指南
動物組織（包括腦、心、肝、脾、肺、腎、肌肉和皮膚等；軟體動物如血吸蟲）：
1）取適量組織器官，用預冷的PBS緩衝液或生理鹽水清洗乾淨；
2）迅速剝去非必需的脂肪和結締組織，再用PBS緩衝液或生理鹽水衝洗乾淨；
3）用乾淨的無塵吸水紙吸乾水分，將組織分成50-100 mg / 管分裝待用；
4）管子上做好標記後迅速放入液氮中冷凍處理至少15 min，-80 ℃凍存；乾冰運輸。
植物組織：
葉片、莖、花：
1）取整片葉片/一段莖/一朵花，放入離心管或錫箔紙中並標記，迅速放入液氮中冷凍處理至少15 min。
2）將裝有樣本的離心管迅速放入自封袋中（每組一袋），在自封袋中放入標籤紙註明樣本信息。
3）迅速放入-80 ℃冰箱凍存。足量乾冰寄送。
注意：（1）採集葉片樣本時，最好在中午光照好的時間收集。（2）採集樣本時保持樣本一致性，尤其是同一組樣本（顏色、衰老程度、葉脈佔比、光照、位置等）。
根：
1）取整株植物的根部，迅速用PBS緩衝液或者超純水漂洗掉根上的泥土、培養基或營養液等；
2）吸水紙吸乾水分後，分裝為500 mg/管；
3）標號後迅速放入液氮中冷凍處理至少15 min，-80 ℃凍存，乾冰寄送。
果實、種子：
1）對於含水量高、體積較大的果實（番茄、西瓜、蘋果等）需要先將樣品分成「均勻」的小塊(≈ 200 mg/樣本)分裝至2 mL離心管中，標號後迅速放入液氮中冷凍處理至少15 min。
2）對於細小的顆粒種子(擬南芥種子、穀物種子等)，可以先將同一組的植株種子混勻後再分裝(≈ 200 mg/樣本)至離心管中，標號後迅速放入液氮中冷凍處理至少15 min。
3）對於要求對整個果實進行提取的（整粒葡萄等），需要把果實裝在50 mL離心管/自封袋中，標號後迅速放入液氮中冷凍處理至少15min，-80 ℃凍存，乾冰寄送。
溫馨提示：
1.對於動物組織樣本無法滿足50mg/樣，如海馬組織，大腦組織等，可考慮同組混樣以達到50mg/樣的要求。
2.對於含水量高的果實進行取樣很難保持高度均一性（如番茄的果皮、果肉等），建議將整個果實進行液氮研磨後凍幹混勻，對混勻後的粉末進行稱重分裝，凍存。
3.儘量不要使用錫箔紙以及自封袋包裝樣本，建議將樣本液氮研磨後使用離心管/凍存管進行分裝。
4.在使用PBS緩衝液/超純水進行漂洗時，需要儘快處理。
5.植物各類組織樣本建議都使用超純水進行漂洗完之後，再研磨分裝凍存，防止因種植過程中施加的一些肥料、農藥等含有表面活性劑或其他雜質，對後續實驗造成影響。
細胞樣本收集指南
懸浮細胞
1）連同培養基轉移到1.5 mL的進口離心管中。
2）低速離心5 min（低於3000 rpm），使細胞沉澱於離心管的底部（1*107個細胞為宜）。
3）倒掉培養基（儘量倒乾淨），用預冷的PBS反覆衝洗2 ~ 3次，低速離心5 min，棄上清。
4）標記離心管，將離心管的尖端插入液氮中，淬滅細胞沉澱1 min，-80 ℃凍存，乾冰寄送。
貼壁細胞：
1）小心棄掉培養液，並將培養皿倒置於吸水紙上儘量吸乾培養液；
2）加入4 ℃預冷的PBS平放輕輕搖動1分鐘洗滌細胞（若用移液槍加，則靠著培養皿壁加入，以免將細胞衝起），然後棄PBS（建議用微量移液器少量多次吸盡殘餘PBS）；
3）將培養皿底部（外壁）接觸液氮，淬滅細胞（1*107個細胞為宜），加入500 μL預冷的甲醇-水（4：1，V/V），用乾淨的細胞刮棒將細胞刮下，用移液槍轉移至1.5 mL離心管
4）繼續加入500 μL甲醇-水（4:1，V/V），將剩餘的細胞儘量全部轉移至離心管中，使用封口膜將離心管密封，保存於-80 ℃，乾冰寄送。
溫馨提示：
1. 培養基傾倒時儘量倒乾淨，可使用濾紙將殘留培養液吸淨；
2. 甲醇/水請使用色譜純及以上規格；
3. 液氮淬滅細胞時，請小心避免離心管破碎導致樣本受損;
4. 建議細胞樣本在進行培養時多準備樣本，以備後續使用;
5. 貼壁細胞收集時如遇培養皿較大，1 mL試劑無法完全轉移完全時，建議加入最大試劑體積不超過 3mL;
6. 若無試劑條件，也可在淬滅細胞後，不加入甲醇-水試劑，直接用乾淨的細胞刮棒將細胞刮下，轉移至離心管;
其他類型樣本收集指南
微生物樣本
適用樣本：大腸桿菌、枯草桿菌、釀酒酵母菌、惡臭假單胞菌、酵母、棒桿菌屬、單胞藻、運動發酵單胞菌、氧化葡萄糖酸桿菌等。
1）連同培養基轉移到進口的15 ml的離心管中，3000 rpm以下低速離心，使細菌沉澱於離心管的底部（1*108個細菌為宜）；
2）倒掉培養基（儘量倒乾淨）後，用預冷的PBS溶液小心重懸清洗沉澱一次，4 ℃ 1000 g離心10 min收集菌體，棄上清；
4）將離心管的尖端插入液氮中，淬滅細菌1 min，然後-80 ℃凍存，乾冰郵寄，每個樣品最好準備兩管以備用。
溫馨提示：
（1）請先拿空離心管的尖端插入液氮中試試離心管的質量，避免因離心管破裂造成樣本損失。
（2）操作儘量迅速，培養基儘量倒乾淨，可用濾紙條將管底部殘留的培養基吸盡。
（3）微生物代謝速度非常快，所有的步驟需儘快完成。
（4）菌體數量不同的樣本間需要保持一致。
（5）菌液的OD值僅供參考，需要根據具體情況確認菌濃度。
微生物培養液（檢測胞外代謝）:
方法一：
培養好的菌液混勻後，取10 mL菌液，用0.2 μm孔徑的過濾膜進行快速抽濾，去除菌體。將濾液按1 mL/管進行分裝，‐80 ℃凍存，乾冰寄送。
方法二：
培養好的菌液混勻後，取1 mL菌液，3000 rpm，4 ℃離心10 min，取上清800 μL，‐80 ℃凍存，乾冰寄送。
微生物—胞外代謝物（細胞上清）
1）使用合適的容器收集細胞培養液或其他生物液體；
2）3000g，4℃，離心15min，小心轉移上清液至新的無菌離心管中；
3）將分離出的細胞上清液16000g，4℃，離心10min（槍頭不要觸碰到管底一側的雜質）小心轉移上清到新的無菌離心管中，-80℃保存。足量乾冰寄送。
溫馨提示：
因培養基中可能含有高糖、高鹽、高滲等成分，可能影響後續質譜上機檢測，因此建議先進行售前諮詢。
體液樣本（如關節液、唾液、膽汁、腦脊液、瘤胃液等）
1）收集體液樣本；
2）3000 rpm， 4 ℃ 離心15 min，取上清，0.5 mL/管分裝至1.5 mL離心管中；
3）-80 ℃冰箱凍存。足量乾冰寄送。
根際土壤樣本
1）去除（抖落）根周鬆散的土：應儘量保證完整的根組織，並去除多餘的土。
2）緩衝液震蕩洗下根際土（緊密粘附）：為防止在震蕩過程中對微生物和根組織細胞的破壞，此處建議直接使用無菌水處理，震蕩時有手動的，也有用搖床等震蕩的，時間和強度根據洗滌的難易程度和根組織而異。
3）高速離心收集沉澱：用無菌水衝處理後之後，可高速離心後收集土壤沉澱，若沉澱較少，也可用提取水體DNA的方法，經0.22μm濾膜過濾收集土壤和微生物或者或者直接真空凍幹處理（無凍幹條件，可直接濁液凍存寄送，由實驗室進行凍幹，再取樣做實驗）。
4）保存：乾冰寄送，低溫-80℃保存。
根系分泌物樣本
1）取整株植物的根部，迅速用1×PBS漂洗掉根上的泥土；
2）將整株根部至於裝有超純水的大容器中，培養一段時間；
3）取一定體積的根系分泌物液體樣本, 1200rpm離心15min，去除雜質，用冷凍乾燥儀凍成乾粉；
4）-80度保存；足量乾冰寄送。
溫馨提示
1. PBS快速衝洗;
2. 根系分泌物所需體積因為培養植物根部分泌物質量不同，所以需要根據最終濃縮成乾粉的量來定；
3. 因為粉末在寄送過程中容易分散到管壁，不好稱重。建議在凍幹前將EP管稱重，凍幹後將EP管和凍乾粉一起稱重後，記錄清楚。
代謝組生物學重複建議
微生物和植物：建議每組生物學重複 ≥ 6 - 8個；
模式動物：建議每組生物學重複 ≥ 8 - 10個；
臨床樣本：建議每組生物學重複 ≥ 30個；
備註：
1. 在允許的條件下，多準備一份樣本備用，且注意分裝保存，避免反覆凍融；
2. 樣本數在10個以內的項目實驗室默認不做QC，如有必要需備註；
3. 樣本需乾冰運輸：快遞途中乾冰消耗率約為5KG/ 天，消耗速度與氣溫，泡沫箱厚度(>5cm)有直接關係，請酌情添加乾冰
樣本量需求：
以上為常見樣本的收集方法以及樣本量需求，如果您的樣本類型不包含在此說明內，歡迎給小鹿留言，我們有非常豐富的代謝樣本收集和預處理的經驗，可以與您分享；如果您收集的樣本量沒有達到以上要求，歡迎諮詢我們的客戶經理/技術支持，進行預實驗測試，我們會以最低的樣本量需求進行最嚴謹、可靠的實驗！
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文章來源於鹿明生物