小A：歐耶！「我的樣本送質譜檢測平臺測完了，數據也拿到了，寫文章、發SCI指日可待！」
小B：唉！「我上周就拿到了，但是我對數據有點疑惑，不確定是樣本問題還是檢測問題，感覺跟我預期有點出入。」
小鹿：「別慌，小鹿有嚴格完善的質量控制體系來幫您！」
以上場景是否時常發生在大家的科研工作中呀？對於樣品量比較多的代謝組學研究，LC-MS/GC-MS檢測方法的難點問題之一就是隨著檢測時間的推移，監測系統會發生細微變化。
那這些變化是可控範圍內的麼？這些變化會導致樣本檢測出現較大偏差嗎？如果有偏差需要怎麼校準呢？
……正因為這些問題的存在，所以在代謝組學分析過程中，實驗人員需要設定嚴格完善的質控體系，以保證數據的高質量。那麼，今天小鹿就和大家聊一聊鹿明生物基於代謝組學前處理以及數據採集中數據質量控制的那些標準。
代謝組學分析的樣本數量往往比較大，為了確保數據的可靠性，代謝組學研究者提出了多種方法進行質控。包括內標的應用、檢測混合物和QC樣品等。小鹿從實驗的前處理與上機兩道重要抓手入手，著重聊一聊關於前處理質控以及上機質控的內容。
第一道門檻——樣品稱重、溶液移取質控
不要小瞧樣品稱重、溶液移取這一步，正所謂「好的開始是成功的一半」，這可是一個實驗的開端。小鹿在最開始進實驗室的時候，可是光練習標準化使用移液槍就整整練習了一天呢！那麼，如何才能把握好這一步質控呢？這就要求稱量同一實驗樣本或者移取試劑時的RSD不超過5%。這樣做的好處是能保持操作一致性，以及不同批次間的重複性。
劃重點——混樣質控（QC樣本）
近年來逐漸有一種趨勢：越來越多的科研雜誌要求作者提供相關的QC操作流程、呈現質控數據等。
了解到大家的需求，小鹿在這邊匯總下QC質控是如何操作的。首先，需要準備一份QC樣本。
要求：
1）它可以是混合相同體積的所有待檢測樣本，然後按照與待測樣本相同的前處理方法來處理QC樣本，之後進樣進行質譜分析；
2）也可以用所有提取好的樣本中取等量混合作為QC；
3）或者用標準品混合液作為QC樣本。
（圖片來源：David B. et al., 2018, Metabolomics）
標準品混合液由商業標準品混合製備，通過檢測已知的代謝混合物，快速評估儀器檢測結果質量（評估內容包括RT穩定性、峰型、檢測器的響應、和檢測器的靈敏度）。標準品混合液測定的數據可用於快速評判儀器的參數設置是否適合待測樣品，並且能夠檢測樣品測定過程中儀器響應是否有較大的變化。
QC樣品檢測能夠提供數據重複性的評價標準。
對於一組樣本數量較少的樣品而言：QC樣品是所有樣品的混合物，通過所有待測樣品的等量混合來製備，能夠代表所有的樣品。
對於樣品數量較多的實驗：如流行病學或多大型多醫學中心聯合臨床研究，需要檢測的樣本數量達到上千個、樣本製備歷時多個月，待測樣品中的代表性樣品可用來製備不同批次的QC樣品，該QC樣本等量分裝後冷凍保存，避免反覆凍融。
說了這麼多，那麼QC質控在具體實驗中是如何操作的呢？
通常我們是混合相同體積的所有待檢測樣本，然後按照與待測樣本相同的前處理方法來處理QC樣本，之後進樣和上機檢測。樣本檢測時，通常在最開始運行5-10個QC樣本，之後根據樣本數量的多少在幾個檢測樣本之間插入一次QC樣本。
（圖片來源：Want E.J. et al., 2010, Nature protocols.）
敲黑板— —內標質控法
除了QC質控法以外，內標的質控法也是代謝組學檢測過程中一個重要的方法。在實驗中針對一類化合物的檢測加入一個或多個內標，內標與待檢測化合物的結構相似或者化學性質相近，內標的RSD不能超過30%。內標法的優點是可以通過上機階段內標物質的信號響應來反映代謝前處理/提取階段的重複性。關於內標的選取原則以及內標類型，小鹿與大家分享一些經驗：
內標選取原則：
1、與待測化合物性質相似；
2、樣本中不存在該化合物，非內源性物質；
3、不與樣本中的代謝物發生反應；
4、內標的添加量接近樣本中被測組分的量。
內標類型：
1、同位素內標；
2、同系物、與目標化合物結構類似的物質；
3、色譜保留時間相近的。
生物學重複— —隨機樣本重複性質控
代謝組學分析一般建議6~8個生物學重複。其目的：
一是為了保證數據的可靠性（樣本數量過少，會導致後續多元統計分析模型過擬合，統計結果不可信）。
另一方面也是作為嚴格質控流程中的一環，通過上機階段所有物質的信號響應來反映樣本前處理/提取階段的重複性。一般認為3個重複樣本的RSD不超過30%，則認為該數據可靠。
進樣順序大有講究
不同的QC樣本類型，可以用來判斷儀器狀態、柱子乾淨程度、流程穩定性、幹擾情況、系統偏差、響應變化等，所以在進樣順序上也大有講究。針對不同檢測目的，進樣順序也會不同，目前較為普遍適用的進樣順序如下圖所示：
①非靶向代謝組檢測分析：
② 精準靶向代謝組檢測分析
實際操作中，針對不同的樣品類型、基質複雜情況以及檢測目的，也會有細微的調整。小鹿結合目前常用的進樣順序以及文獻發表的進樣順序，進行了優化調整，也是目前我司常用的進樣順序：
圖1 | GC-MS/LC-MS非靶向代謝組學
圖2 | GC-MS/LC-MS精準靶向代謝組學
QC混樣的數據評估——數據可靠的有力保障
QC樣本在樣本檢測前用於平衡「色譜-質譜」系統，在樣本檢測過程中用於評價質譜系統的穩定性。QC樣品的分析步驟可分為：QC樣本的RSD篩選；QC樣本TIC疊加圖；QC樣本主成分分析；對QC代謝物強度分布進行評估；以及QC樣本層次聚類。
QC樣本的RSD篩選
刪除QC組RSD>40%的離子峰。相對標準偏差（Relative standard deviation，RSD）是標準偏差與測量結果算術平均值的比值，是一種量度數據分布的分散程度的標準，用以衡量數據值偏離算術平均值的程度。標準偏差越小，這些值偏離平均值就越少，反之亦然。
如果是精準靶向代謝組學分析的樣本，還可以先將所有物質的QC按照響應（峰面積）進行作圖（如下圖），更直觀地觀察到QC在整個項目過程中是否保持穩定，以更好地監控儀器工作穩定性。一般要求：QC混樣對應物質峰的保留時間不超過0.1min及峰面積值RSD不超過40%。
圖3 | 將所有物質的QC按照響應（峰面積）進行作圖
QC樣本TIC疊加圖
將QC樣本的總離子流圖進行譜圖重疊比較，如下圖。結果表明各色譜峰的響應強度和保留時間基本重疊,說明在整個實驗過程中儀器偏差引起的變異較小。
圖4 | TIC圖疊加分析
QC樣本主成分分析（PCA）
PCA分析是簡單多元數據分析的初步方法，從概念上來講，如果樣品分析做得很好，PCA應該顯示第一個平衡系統QC樣品對之後系統平衡QC樣品的追蹤現象。下圖顯示了一個基於LC-MS的非靶向代謝組學項目的PCA得分圖，圖中最開始的QC樣品用紅色標識出來。圖中可以看到前3個系統平衡階段的QC樣品對系統平衡後QC樣品的追蹤現象。而系統平衡後QC樣本緊密聚集在一起表明，數據值得進一步的分析。
（圖片來源：Want E J, Wilson I D, Gika H, et al. Global metabolic profiling procedures for urine using UPLC–MS. Nature protocols, 2010, 5(6): 1005-1018.）
對QC代謝物強度分布進行評估
對QC樣本的代謝物強度做Boxplot,如下圖,其中Y坐標為質譜強度log10值,為保證箱線圖可視化最多對60個樣本進行繪製。
QC樣本層次聚類
為了更直觀的展示QC樣本與其他樣本之間的關係及QC樣本間的穩定性，我們對所有代謝物表達量進行層次聚類（Hierarchical Clustering）,如下圖所示。
不可忽視的內標質控
對於實驗過程中加入的內標進行質控，可以有效評價前處理過程和樣本檢測中質譜系統的穩定性，同時減少實驗誤差對於後續數據的影響。對實驗過程中添加的L-2-氯苯丙氨酸(3,4-Dichlorophenylalanine)和11種脂肪酸甲酯內標進行人工定性檢測確認：根據內標的離子碎片及其保留時間定性L-2-氯苯丙氨酸和11種脂肪酸甲酯內標。
對於定性得到的內標，進行RSD篩選。將所有樣本中RSD＞0.3的內標刪除，保留RSD<0.3的內標,用於後續的數據預處理的分段歸一化。
對L-2-氯苯丙氨酸和11種脂肪酸甲酯內標進行TIC的提取，如果代謝物檢測總離子流圖的曲線重疊性高，即不同時間段採集的技術重複樣本保留時間和峰強度一致性好，表明質譜以及液相系統不同時間段的信號穩定性較好。如下圖分別是不同樣本的L-2-氯苯丙氨酸和11種脂肪酸甲酯內標的TIC疊加圖：
圖5 | TIC圖：L-2-氯苯丙氨酸
圖6 | TIC圖：11種脂肪酸甲酯內標
做實驗、寫文章猶如闖關遊戲，每一環節都可能暗藏陷阱。但如果能在實驗及數據採集前做好質量控制方案，在寫文章投稿之前對質控數據進行細緻的整理，嚴格把關數據質量，那麼在回覆審稿人對數據可靠性及質量控制的疑問時，你是不是能更胸有成竹、有理有據呢？
QA/QC越嚴格，數據越可靠
關於實驗室的質量管理體系，小鹿有一些些經驗，可供大家參考：
非靶向代謝組的平臺，針對GC-MS/LC-MS不同平臺、不同類型的化合物進行了優化，以覆蓋更多的代謝物；
對MS和UPLC進行嚴格管理、定期維護，包括定期更換進樣針、襯管及隔墊、清洗離子源、檢查泵壓，以保證平臺硬體的最佳狀態；
前處理部分，進行多種內標質控，GC-MS的前處理以及衍生化環節、LC-MS的提取及揮幹復溶環節均有不同的內標進行質控，以確保前處理的穩定；
建立完善的QA/QC質控體系；
細緻的數據處理環節和人工核驗流程；每一個化合物的色譜峰，積分，MS1和MS2都經過二次確認，以確保數據的可靠性。
參考文獻：
1.Want, E. J., I.D. Wilson, H. Gika, G. Theodoridis, R. S. Plumb, J. Shockcor, E. Holmes and J.K. Nicholson (2010). "Global metabolic profiling procedures for urineusing UPLC-MS." Nat Protoc5(6):1005-1018.
2.David Broadhurst1 · Royston Goodacre2 ·Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies. Metabolomics (2018) 14:72.
猜你還想看
◆小鹿話代謝第一期：代謝組學——後基因組時代新熱點
◆小鹿話代謝第二期：還在為實驗發愁？看完這篇科研好文我被「種草」了
◆小鹿話代謝第三期：一看到導師就害怕？你也有「導師恐懼症」嗎
◆小鹿話代謝第四期：看完秒懂，代謝組學醫藥領域機制研究實驗設計方案怎麼做？
◆小鹿話代謝第五期：標誌物篩選、藥效評價保姆級研究實驗思路！了解一下~
◆小鹿話代謝第六期：Get農學領域——標誌物篩選、機理研究的代謝組學實驗設計方案！
◆小鹿話代謝第七期：代謝組學樣本收集知多少~超全攻略讓你輕鬆get！！！
◆小鹿話代謝第八期：組學研究「糞便君」樣本如何收集？這裡有高招哦~
END
文章來源於鹿明生物