項目文章|iTRAQ定量蛋白質組學助力南京農大茶樹抗寒機制研究

2021-01-10 騰訊網

前言

歐易/鹿明生物合作客戶南京農業大學課題組在BMC Plant Biology期刊發表的題為 「Physiological and iTRAQ-based proteomic analyses reveal the function of exogenous γ-aminobutyric acid (GABA) in improving tea plant (Camellia sinensis L.) tolerance at cold temperature」的研究成果，iTRAQ標記定量蛋白組學分析可以解釋GABA誘導的茶樹抗寒生理效應。功能蛋白-蛋白質網絡分析進一步表明，內源GABA和脅迫響應物質的變化誘導了茶樹光合作用、胺基酸合成和碳氮代謝之間的相互作用，相應的差異有助於茶樹抗寒性的提高。

中文標題：生理和iTRAQ蛋白質組分析揭示了外源γ-氨基丁酸（GABA）在提高茶樹耐低溫能力中的作用

研究對象：茶樹

發表期刊：BMC Plant Biology

影響因子：3.497

合作單位：南京農業大學

運用歐易/鹿明生物技術：iTRAQ標記定量蛋白質組學（由鹿明生物提供技術支持）

研究背景

茶葉是世界上最受歡迎的非酒精飲料之一，茶樹是中國、印度、斯裡蘭卡和肯亞等許多國家最重要的商業作物之一。冷脅迫很容易幹擾光合作用過程，光合作用過程是植物生產所需的最重要的過程，當茶樹經歷低溫條件時，各種機制被調用，包括抗氧化能力、滲透調節、光合速率降低和GABA積累。這些過程涉及冷反應基因的表達，其中許多是由GABA調控。然而，對於處於最適溫度和低溫下的茶樹來說，GABA調節哪些蛋白質在很大程度上是未知的。在本研究中，作者通過對茶樹在適宜溫度和低溫下的生理學和iTRAQ蛋白質組分析，探討了GABA的耐受機制。

研究策略

研究結果

1、不同溫度對茶葉內源GABA和穀氨酸含量的影響

低溫處理第7天，茶葉內源GABA含量顯著下降，第4天則無明顯變化。然而，穀氨酸含量並沒有表現出明顯的變化（圖1）。在最適溫度下，GABA和穀氨酸的含量表現出幾乎相同的趨勢，均在0-4d內逐漸增加（圖1）。在兩種不同的溫度下，茶樹內源GABA含量隨外源GABA的施用而顯著變化，但只有在第7天的最適溫度下，內源穀氨酸含量才顯著變化（圖1）。

圖1 | T1-T4處理期間內源GABA和穀氨酸含量的變化

T1：25℃、T2：25℃+GABA、T3：4℃、T4：4℃+GABA，數據表示平均值±標準差。

2、葉綠素螢光瞬變和JIP試驗的SPAD值及耐性分析

在不施用外源GABA的情況下，較低溫度下SPAD值顯著低於最佳溫度。然而，外源GABA在整個實驗過程中提高了SPAD值（圖2）。在無外源GABA的情況下，葉片在最適溫度下的螢光瞬變曲線在0-7天呈現典型的OJIP形狀。與最佳溫度相比，冷處理的OJIP曲線的J階躍生長速度要慢得多。相反，與不添加GABA相比，無論溫度如何，外源GABA導致OJIP曲線的J階躍水平顯著增加。這種敏感性進一步證實了外源GABA提高茶樹的耐寒性（圖2）。

圖2 | 在T1-T4處理期間通過葉綠素螢光瞬變和JIP試驗分析SPAD值的變化和耐受水平

3.溫度及外源GABA處理對葉片蛋白質組學的影響

運用iTRAQ標記定量蛋白質組學，根據標準（FDR≤0.05，唯一肽數≥2），從T1-T4組鑑定出1469個蛋白。根據差異蛋白（DAPs）篩選標準（FC > 1.5, p

層次聚類分析結果顯示T2/T1、T3/T1、T4/T1、T4/T2和T4/T3的DAPs具有不同的表達模式（圖3A）。T3/T1和T4/T3共有97個DAP，T2/T1和T4/T3共有54個DAP，T3/T1和T4/T1共有82個DAP（圖3B）。其中有28、17、25、14和50個DAPs分別在T2/T1、T3/T1、T4/T1、T4/T2和T4/T3中獨立表達（圖3B）。

圖3 | 聚類分析

（A）聚類分析中的DAPs和（B）暴露於T2/T1、T3/T1、T4/T1、T4/T2和T4/T3處理7天後的茶樹葉片數。

4. DAPs對外源GABA反應的GO和COG分析

通過GO分析，從細胞組成、生物學功能和分子功能等方面對T2/T1、T4/T1和T4/T3進行了蛋白質注釋。根據分子功能將T2/T1、T4/T1和T4/T3的DAPs分為9類。並分別對3個比較組中的主要功能類別及DAPs的在茶樹葉片中的主要細胞定位作了比較詳細的展示（圖4）。

圖4 | DAPs對外源GABA反應的GO和COG分析

T2/T1組中DAPs主要功能分類（A）和在茶樹葉片中的細胞定位分布（B）；

T4/T1組中DAPs主要功能分類（C）和在茶樹葉片中的細胞定位分布（D）；

T4/T3組中DAPs主要功能分類（E）和在茶樹葉片中的細胞定位分布（F）；

接著作者為了探討外源GABA和溫度對蛋白質胺基酸轉運的影響，觀察了胺基酸轉運相關蛋白在T2/T1、T3/T1、T4/T3、T4/T1和T4/T2反應中的表達模式。有36種蛋白質被鑑定與胺基酸轉運有關（圖5），其中一些在應激反應物質的產生和代謝途徑中有重要作用。

結果表明，在適宜溫度和低溫條件下，外源GABA處理的茶樹胺基酸轉運具有不同的表達模式。T3/T1和T4/T1相比，富含甘氨酸的RNA結合蛋白2（Q9SVM8）、3-磷酸莽草酸1-羧乙烯基轉移酶（P05466）、烯醇化酶1（Q9C9C4）和果糖二磷酸醛縮酶3（Q9ZU52）的表達模式相同；醛縮酶超家族蛋白（F4IC59）、亮氨酸氨基肽酶2（Q944P7）的表達模式相同。T4/T1處理與T3/T1處理間無明顯差異，T4/T1處理與T3/T1處理間多數胺基酸轉運蛋白呈相反趨勢。這些結果表明，外源GABA在低溫脅迫下可使茶樹體內的胺基酸轉運向緩解低溫脅迫的應激反應物質方向轉移。所有胺基酸轉運蛋白在T3/T1和T4/T3處理間均呈現相反的表達模式，說明在蛋白質水平上，有無外源GABA對低溫脅迫有不同的緩解機制。

結合先前的研究表明，外源GABA可能導致胺基酸轉運參與代謝途徑以適應低溫脅迫。

圖5 | T2/T1、T3/T1、T4/T1、T4/T2和T4/T3處理7d後茶葉胺基酸轉運代謝中DAPs的聚類分析

5.外源GABA低溫響應的相互作用網絡分析

接著作者對T4/T3處理組中差異蛋白進行了PPI蛋白互作網絡分析，其中涵蓋了47中蛋白質（圖6）。這些蛋白質在功能上可分為光合生物體的碳固定（13種蛋白質）、乙醛酸鹽和二元酸鹽代謝、胺基酸生物合成（17）、磷酸戊糖途徑（8）、黃酮生物合成（4）、穀胱甘肽代謝（6）、TCA循環（5）、抗壞血酸和醛酸代謝（4）和嘌呤代謝等。這些可能是茶樹在有外源GABA和無外源GABA時對低溫反應的關鍵點。

圖6 | T4/T3處理組茶葉中DAPs的相互作用網絡

說明：點代表蛋白質，紅色代表表達增加，綠色代表表達減少。圓形矩形代表生物過程、細胞定位、分子功能或信號傳導途徑；藍色代表顯著較高，黃色代表較低的顯著性。線表示彼此之間的關係；實線表示與相關驗證的關係，虛線表示未驗證

研究結論

圖7 | 外源GABA低溫下對代謝途徑中生理指標和DAPs的影響

（1）GABA有效地提高了茶樹耐低溫性，並在較高的SPAD值、葉綠素螢光瞬變和膜穩定性、抗氧化活性調節等方面反映了最佳條件下的各種生理生化過程；

（2）基於iTRAQ的蛋白質譜分析為揭示植物耐受性的代謝過程提供了一條全方面的道路，植物的低溫耐受性是由內源性GABA調控的；

（3） 內源性GABA的轉化不僅在功能蛋白網絡中得到了進一步的證實，而且在代謝途徑中也得到了揭示，如類黃酮代謝、胺基酸代謝、AsA/穀胱甘肽循環、TCA循環、乙醛酸循環、光合生物體的碳固定等；

小鹿推薦

茶樹體內γ-氨基丁酸（GABA）與逆境反應物質相互作用，可能參與在適宜溫度和低溫脅迫下差異豐度蛋白（DAPs）的調節。本研究中，將添加或不添加5.0 mMγ-氨基丁酸的茶樹置於適宜溫度或低溫下生長。外源GABA引起的GABA水平的升高改變了穀氨酸、多胺和花青素等應激反應物質的水平，從而提高了抗寒性。基於iTRAQ技術發現DAPs參與了蛋白質代謝、核苷酸代謝、能量和胺基酸的轉運代謝等生物過程、無機離子的轉運和代謝、脂質代謝、碳水化合物的轉運的代謝、次級代謝物的合成、抗氧化和應激反應過程。

iTRAQ分析可以解釋GABA誘導的茶樹抗寒生理效應。功能蛋白-蛋白質網絡分析進一步表明，內源GABA和脅迫響應物質的變化誘導了茶樹光合作用、胺基酸合成和碳氮代謝之間的相互作用，相應的差異有助於茶樹抗寒性的提高。

文末看點

上海鹿明生物科技有限公司，一直專注於生命科學和生命技術領域，是國內早期開展以蛋白組和代謝組為基礎的多層組學整合實驗與分析的團隊。經過近數年的發展沉澱，公司建立起了iTRAQ/TMT、DIA、PRM、修飾蛋白組等蛋白組學技術平臺和全譜代謝組、靶向代謝組、擬靶向代謝組、脂質組等代謝組學技術平臺以及相應的數據整合分析平臺，並建立了科學完整的服務流程和精細規範的操作標準。

參考文獻：

Zhu X , Liao J , Xia X , et al. Physiological and iTRAQ-based proteomic analyses reveal the function of exogenous γ-aminobutyric acid (GABA) in improving tea plant (Camellia sinensis L.) tolerance at cold temperature[J]. BMC Plant Biology, 2019, 19(1).

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END

文章來源於鹿明生物

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