TMT蛋白質組學陳利玉揭示銀納米顆粒抗銅綠假單胞菌生物膜機制

前言

2020年6月中南大學基礎醫學院陳利玉課題組在Journal of Proteome Research發表的題為 「Quantitative proteomics reveals the mechanism of silver nanoparticles against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa biofilm」的研究成果，通過TMT標記定量蛋白質組學研究方法，發現銀納米顆粒通過抑制銅綠假單胞菌的粘附和運動，刺激強烈的氧化應激反應，破壞鐵穩態等多種方式抑制了銅綠假單胞菌生物膜，為闡明銀納米顆粒對抗生物膜的機理提供了新的見解，從而為其臨床應用提供了理論基礎。

中文標題：定量蛋白質組學揭示銀納米顆粒抗耐藥綠膿桿菌生物膜的機制

研究對象：銅綠假單胞菌（綠膿桿菌）

發表期刊：Journal of Proteome Research

影響因子：4.074

運用生物技術：TMT定量蛋白質組學

研究背景

銅綠假單胞菌是一種常見的機會病原體，可導致嚴重的眼、耳、泌尿道和呼吸道感染。由於抗生素的濫用，該菌的耐藥率逐年提高。其抗生素抗性的機制涉及許多方面，生物膜形成是其中重要的機制。細菌生物被膜是指細菌粘附於接觸表面，分泌多糖基質、纖維蛋白、脂質蛋白等物質，將其自身包繞其中而形成的大量細菌聚集膜樣物，其是細菌為適應自然環境有利於生存的一種生命現象。生物膜的抗生素抗性有著多方面的機制，包括細胞外聚合物（EPS）阻礙抗生素的滲透，生物膜深處細菌缺乏養分和氧氣導致代謝水平低等機制。因此，迫切需要開發新的抗生物膜藥物。

銀納米顆粒（AgNPs）是一種新型的廣譜抗菌劑，且其對哺乳動物細胞顯示出低細胞毒性。近年來，已經發現AgNPs不僅影響浮遊細菌，而且對細菌生物膜也有影響。生物膜變性測試表明，超過90％的細菌生物膜被AgNPs破壞[1]。先前研究結果表明，AgNPs可以誘導抗耐多藥銅綠假單胞菌的氧化應激[2]。然而，它僅驗證了AgNPs對耐多藥銅綠假單胞菌浮遊階段的影響，仍需要探索AgNPs對耐多藥銅綠假單胞菌生物膜的作用機理。

研究思路

研究結果

1.AgNPs抑制生物膜形成

作者用結晶紫法評估銅綠假單胞菌的生物膜生物量。結果表明，銅綠假單胞菌在靜態培養4小時後開始形成生物膜，並且生物膜生物量隨培養時間的延長而顯著增加（圖1A）。當暴露於不同濃度的AgNPs時，銅綠假單胞菌生物膜的生物量以濃度依賴性的方式降低（圖1B）。

圖1 | AgNPs阻止銅綠假單胞菌生物膜形成

2.AgNPs破壞已存在的生物膜

AgNPs以濃度依賴性方式破壞了預先形成的生物膜（圖2A）。當用低濃度的AgNPs處理1小時後，生物膜的生物量開始顯著減少，但是經過6小時的AgNPs處理後，生物膜恢復了生長（圖2B）。而當暴露於高濃度AgNPs1小時後，生物膜生物量顯著減少，處理6小時後生物膜生物量仍然處於較低水平（圖2B）。結果表明，AgNPs對生物膜的破壞作用與其濃度呈正相關。

圖2 | AgNPs引起銅綠假單胞菌生物膜分散

3.AgNPs破壞了生物膜結構

將預先形成的銅綠假單胞菌生物膜暴露於AgNPs 24小時，並且通過掃描電鏡觀察生物膜結構和生物膜生物量。對照組的細菌細胞膜是完整的，生物膜中的細菌顯示緊湊的排列且表面光滑（圖3A和B）。當銅綠假單胞菌暴露於AgNPs後，生物膜從蓋玻片表面脫落，且通常伴隨著生物量減少和結構變形或破裂。此外，細菌因其內含物釋放而變得腫脹或萎縮（圖3C和D）。

圖3 | 銅綠假單胞菌生物膜的掃描電鏡圖像

（A，B）對照組生物膜；

（C，D）AgNPs處理過的生物膜；

4. 蛋白質組學揭示AgNPs破壞生物膜的機制

為了進一步了解AgNPs對抗生物膜的潛在機制，作者通過TMT蛋白質組學分析了AgNPs對生物膜蛋白表達的影響（圖4A）。結果發現AgNPs處理1小時後，銅綠假單胞菌中有317種蛋白質上調，324種蛋白質下調（圖4B）。

GO富集分析表明上調蛋白富集在「抗氧化活性」、轉運蛋白活性」等條目中（圖4C），而下調蛋白富集在「電子載體活性」，「核糖體的結構成分」等條目中。KEGG通路富集分析表明由AgNPs誘導的差異蛋白集中在「氧化磷酸化」，「氮代謝」，「細菌趨化性」，「鞭毛裝配」和「核糖體」等通路（圖4D）。

4.1.AgNPs影響生物膜細菌的粘附和運動

TMT蛋白質組學結果表明，多數鞭毛蛋白、菌毛蛋白和生物膜的趨化性相關蛋白在AgNPs處理的生物膜中下調（圖5A），從而抑制細菌的粘附和運動。與對照組相比，低濃度的AgNPs顯著抑制了銅綠假單胞菌的遊動(swimming)、湧動(swarming) 和顫動(twitching motility)（圖5B, C, D）。

圖5 | AgNPs對銅綠假單胞菌黏附和運動的影響

4.2.AgNPs誘導強烈的氧化應激反應

根據以往研究結果，作者推測氧化應激也可能是AgNPs對抗生物膜的機制之一。實驗結果表明暴露於AgNPs 1小時後，銅綠假單胞菌生物膜的ROS螢光強度會隨著AgNPs濃度的增加而顯著增加（圖6A）。但是添加GSH或AsA後，ROS的相對螢光強度明顯降低，生物膜生物量增加（圖6C）。這些結果表明AgNPs通過誘導氧化應激發揮抗生物膜的作用。TMT蛋白質組學分析表明，AgNPs刺激銅綠假單胞菌生物膜中的氧化應激，其中過氧化氫酶（KatA，KatB和KatE），超氧化物歧化酶（SodA），烷基氫過氧化物還原酶（PA0269，PA0848和PA0565）和有機過氧化氫抗性蛋白（Ohr）的水平明顯較高。（圖6D）。此外，經AgNPs處理的生物膜中，參與核酸複製、轉錄相關的蛋白質（DeaD，RhlE，Rep，RapA和RpoZ）和DNA修復的蛋白質豐度較低（圖6D）。qRT-PCR驗證katA，katB，ohr的結果與蛋白質組學結果一致（圖6E）。

圖6 | AgNPs誘導銅綠假單胞菌生物膜中的氧化應激

4.3.AgNPs破壞鐵穩態

TMT蛋白質組學結果表明AgNPs處理後鐵離子攝取相關蛋白豐度升高，而鐵存儲蛋白和鐵硫簇合成蛋白顯著減少（圖7A），這表明銅綠假單胞菌生物膜中鐵穩態的失衡可能增加ROS的產生並導致氧化損傷。

圖7 | AgNPs對銅綠假單胞菌生物膜中鐵代謝相關蛋白的影響

4.4.AgNPs影響有氧和無氧呼吸

隨著生物膜的發展，生物膜的內部變得高度缺氧。而且，ROS的產生消耗大量的氧氣，這進一步降低了細菌局部環境中的氧氣壓力。在五種已知的銅綠假單胞菌末端氧化酶中，細胞色素cbb3型氧化酶因其在微需氧條件下對銅綠假單胞菌生存的關鍵作用而被廣泛研究。TMT蛋白質組學發現AgNPs處理後，CcoN1，CcoN2和CcoP2的表達下降（圖8A）。此外，銅綠假單胞菌能夠使用硝酸鹽作為末端電子受體進行無氧呼吸，而蛋白質組學結果發現硝酸鹽還原酶（NAR）和亞硝酸鹽還原酶（NIR）均因AgNPs處理而降低（圖8A）。測量NIR活性實驗表明表明AgNPs處理的生物膜的NIR活性顯著低於對照組（圖8B）。這些結果證實AgNPs可以通過抑制銅綠假單胞菌生物膜的需氧和厭氧呼吸而發揮抗生物膜作用。

圖8 | AgNPs對銅綠假單胞菌生物膜有氧和無氧呼吸的抑制作用

4.5.AgNPs影響群體感應信號

群體感應（quorum sensing）可以調節細菌的表型變化並協調行為反應，例如產生毒力因子、運動性和生物膜形成。因此，作者評估了AgNPs對群體感應系統的影響。鄰氨基苯甲酸（anthranilic acid）是PQS信號分子的生物合成前體。蛋白質組學結果表明，AgNPs處理後參與鄰氨基苯甲酸降解的蛋白質豐度升高。此外AgNPs顯著降低了花青素（pyocyanin），鼠李糖脂（rhamnolipid）和彈性蛋白酶（elastase）的產生（圖9）。

圖9 | AgNPs對銅綠假單胞菌生物膜中群體感應信號和毒力因子表達的影響

研究結論

文章結果表明AgNPs可以有效抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成，並對預先形成的生物膜具有分散作用（dispersing effect）。蛋白質組學分析表明，AgNPs可能通過幹擾多種生理過程來對抗銅綠假單胞菌生物膜。暴露於AgNPs可能會干擾生物膜中細菌的鐵穩態繼而導致ROS產生。過量的ROS會引起脂質過氧化，DNA和核糖體的損傷以及大分子合成的減少，從而導致細菌死亡。ROS的產生也消耗大量的氧氣，這降低了生物膜局部環境中的氧氣水平，並加劇了低氧應激反應。此外，AgNPs處理可能會抑制有氧和厭氧呼吸酶的功能，結果，細菌將無法適應缺氧應激而死亡。另外，ROS的產生可能影響群體感應系統並抑制毒性因子的表達。總之，AgNPs可以通過細菌的代謝途徑改變生物膜的結構和屬性，從而最終減輕或消滅生物膜中的細菌（圖10）。

圖10 | AgNPs對銅綠假單胞菌生物膜的作用機理模型

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銀納米顆粒作為新型的抗菌劑，可以消滅生物膜並降低細菌的抵抗力，但其抗生物膜的作用機理尚未闡明。本文結合掃描電子顯微鏡和TMT標記定量蛋白質組學研究了AgNPs抗銅綠假單胞菌的分子機制。作者發現蛋白質組學結果與表型實驗結果相互印證，並結合數據分析推測AgNPs對生物膜的作用機制，其數據分析思路值得借鑑和參考。

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文章來源於鹿明生物