前沿研究丨阪崎克羅諾桿菌生物膜的形成機制及清除防控策略

本文選自中國工程院院刊《Engineering》2020年第4期

作者：凌娜，Stephen Forsythe，吳清平，丁鬱，張菊梅，曾海燕

來源：Insights into Cronobacter sakazakiiBiofilm Formation and Control Strategies in the Food Industry[J].Engineering,2020,6(4):393-405.

編者按

阪崎克羅諾桿菌（Cronobacter sakazakii）是一種食源性條件致病菌，可引起壞死性腸炎、腦膜炎和嬰兒敗血症等危及生命的侵襲性疾病。據研究表明，受該菌汙染的嬰幼兒配方奶粉，存在很大的潛在風險，並已引起乳品生產商、監管機構和消費者的廣泛關注。

阪崎克羅諾桿菌可在不同食品生產環境和設備表面形成生物膜，並成為食品持續汙染的重要來源。然而，該細菌生物膜由於耐藥特性強難以去除，傳統的清洗和消毒程序不足以完全控制生物膜，並且可能會導致進一步的生物膜形成和擴散。阪崎克羅諾桿菌生物膜是如何形成的？如何清除與防控生物膜？

近期，中國工程院吳清平院士科研團隊在中國工程院院刊《Engineering》撰文指出，「防勝於治」，對生物膜形成機制的深入研究，對食品生產環境的設計及生物膜防控具有重要意義。文章重點闡述了C. sakazakii生物膜的形成機制及控制策略，分析了原位清洗系統、物理處理、化學處理、生物過程以及潛在的納米技術、信號阻抑等控制手段在應對生物膜防控上面臨的挑戰，並為食品加工廠如何進行生物膜防控提供了建議。

一、引言

克羅諾桿菌屬（Cronobacterspp.）由7個具有致病性的菌種組成，分別為阪崎克羅諾桿菌（C. sakazakii）、丙二酸鹽克羅諾桿菌（C. malonaticus）、蘇黎世克羅諾桿菌（C. turicensis）、莫金斯克羅諾桿菌（C. muytjensii）、康帝蒙提克羅諾桿菌（C. condimenti）、尤尼沃斯克羅諾桿菌（C. universalis）和都柏林克羅諾桿菌（C. dublinensis），原先統稱為阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）。

C. sakazakii是Cronobacterspp.中感染性最強的一個菌種。Cronobacterspp.是一類具有周生鞭毛，能運動，在好氧和厭氧條件下均可生長的革蘭氏陰性桿菌。該菌可引起各個年齡人群感染，特別是在新生兒、小於6個月的嬰兒和老年人中的感染率較高。由於C. sakazakii與新生兒嚴重疾病的感染暴發密切相關，因此該菌已引起監管當局的高度重視。

國際食品微生物標準委員會（International Commission on Microbiological Specification for Foods, ICMSF）將Cronobacter列為「嚴重危害特定人群生命、引起長期慢性實質性後遺症的一種致病菌」。該菌可導致低出生體重新生兒和年齡小於6個月（斷奶前）的嬰兒患腦膜炎、壞死性腸炎和呼吸道感染等威脅生命的症狀，其中伴有神經後遺症或迅速死亡病症的死亡率為40%~80%。此外，C. sakazakii 也會感染其他年齡人群，儘管已有報導發現該菌可在學生中暴發急性腸胃炎，但其主要的感染人群是免疫功能低下的成年人。該菌可導致成人多種症狀，如菌血症、闌尾炎、敗血症、骨髓炎、肺炎、脾膿腫、傷口感染和尿路感染。

C. sakazakii廣泛分布於環境中，包括嬰幼兒配方奶粉（powdered infant formula, PIF）、蔬菜、即食食品、水、乾糧、藥用植物、香料和蒼蠅。由於Cronobacter 具有強抗乾燥能力，能夠產生多糖莢膜，並分泌黃色類胡蘿蔔素色素以保護其抵抗氧自由基的侵害，所以研究者推測該菌的主要自然源可能是植物。此外，在家庭環境和食品生產設備中也均發現了該菌。

為了適應不同的生長環境，細菌形成稱為生物膜（biofilm）的動態空間組織。這是微生物重要的適應性生存策略，食源性病原體可以通過這種策略保護自己免受環境脅迫。生物膜中的細菌作為一個群落存在，其生理特性不同於浮遊態的細菌。它們在細胞-細胞間進行合作與競爭，相互傳遞信號分子，並進行基因的水平轉移。因此，它們保持「亦敵亦友」的關係。生物膜的獨特形態和生理結構因其包含的微生物及駐留的微環境條件而異。細胞在生物膜內的變化是通過感知和響應各種外部環境信號而實現，通過對這些環境信號的交互響應，細菌能夠協調其基因表達並適應不斷變化的環境。

研究表明，C. sakazakii 可以附著在矽、乳膠、聚碳酸酯、不鏽鋼、玻璃、聚氯乙烯等非生物材料表面並形成生物膜。值得注意的是，C. sakazakii在PIF中的存活和持續汙染與該菌引起的感染暴發密切相關。因此，C. sakazakii需具有適應PIF嚴苛的高滲透和強幹燥條件的能力。Beuchat等發現，C. sakazakii 的生物膜態細胞在低溼度條件下比其浮遊細胞生存力更強。在奶粉加工廠的環境（空氣過濾器、地板、鞋子、卡車、屋頂）和加工設備（滾筒烘乾機、空氣過濾器）中均能檢測到該菌，並且該菌可能會在這些物質上存留幾個月。此外，C. sakazakii 也會在新生兒餵食管上形成生物膜，這可能會增加新生兒獲得感染的風險。近期，生物膜狀態被認為是細菌的默認生活方式，而浮遊態細胞可能只是細菌生命的一個過渡階段。而食品微生物汙染主要與食品接觸面上細菌生物膜的形成有關。整個食品加工鏈中接觸面上的物質可以為生物膜的發展和持留提供堅實的基質，從而難以去除的生物膜將導致食品的細菌汙染並對消費者構成潛在的健康風險。因此，如何防控由C. sakazakii 生物膜引起的食品汙染是食品行業亟待解決的共性關鍵難題。

以往對生物膜的研究重點關注生物膜及控制食品汙染的方法研究。近年來，多組學研究和成像技術的快速發展揭示了細菌生物膜內複雜的空間組織及其形成過程，更準確地了解生物膜將為生物膜去除方法的研發提供理論基礎。然而，由於目前對C. sakazakii 的研究仍處於初級階段，因此，對其生物膜的控制手段尚不明確。

本文根據C. sakazakii 生物膜現有的研究進行系統性的概括，包括生物膜形成機制、傳統和創新的生物膜控制策略以應對生物膜面對的挑戰，並討論了如何將這些控制手段應用於食品工業中C. sakazakii 生物膜的防控。

二、生物膜形成機制

「防勝於治」，因此，生物膜形成機制的深入研究將對食品生產環境的設計及生物膜防控具有重要意義。生物膜是一種可在各種表面形成，由不同生物聚合物組成的胞外基質所包裹的複雜微生物群集。通過掃描電鏡（scanning electron microscopy, SEM）和雷射共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscopy, CLSM）等手段對C. sakazakii 生物膜的形成過程進行觀察，結果發現這是一個從附著、成熟、擴散到下一輪附著的一系列動態過程。起初，浮遊細菌附著在載體表面並分泌大量的胞外聚合物。隨著細胞的生長，細菌聚集在一起形成增厚的生物膜，且在72 h時，生物膜的生長達到最大值。而當生長到96 h時，生物膜已脫離介質表面並釋放細菌（圖1）。由此可見，C. sakazakii 生物膜的整體形成過程與其他細菌相似。該菌擁有多種能實現細胞間通信的分子機制，將細胞附著在非生物表面並成長為有彈性的結構，從而形成生物膜。

圖1 不同物質對生物膜形成的抑制作用。（a）生物膜形成的動態過程，包括附著、成熟、擴散和下一輪附著；周期過程通常包括6個步驟，如圖所示。（b）物質在生物膜形成的不同步驟中的去除作用，如掃描電鏡圖像（×2500）所示。生物膜用碘化丙啶和SYTO9染色，CLSM觀察

（一）影響C. sakazakii生物膜發育的環境因素

1. 培養條件

生物膜的形成是一個受環境變化影響的複雜過程。C. sakazakii 生物膜形成能力和胞外多糖（extracellular polymeric substances, EPS）的分泌因環境條件的不同而改變，包括接觸面性質、營養有效性和相對溼度。Ye等對23株C. sakazakii 在不同孵育時間、pH值、溫度條件下生物膜形成能力進行評估。結果表明，生物膜形成過程中多糖的生物量和性質呈現菌株特異性，並受其培養微環境的影響。在乳製品生產過程中，生物膜的生長可能也與EPS和牛奶殘渣（主要是蛋白質和磷酸鈣）有關。牛奶成分也影響Cronobacter生物膜的形成。脫脂乳中乳清蛋白和酪蛋白比乳糖對Cronobacter 生物膜形成的影響更大，且氮源對其的影響大於碳水化合物。此外，Ye等還比較了Ca²⁺和Mg²⁺對從PIF分離的C. sakazakii 生物膜的影響。結果顯示，二價陽離子濃度對生物膜總生物量有一定的影響，1.50% MgCl₂和0.25% CaCl₂為其最佳生長條件。並且，二價陽離子還能改變細胞外基質的生物量特性。

2. 接觸表面

接觸面是生物膜形成的先決條件之一。接觸表面的性質將影響細胞黏附和隨後生物膜的形成。當細胞接觸和黏附介質時，這兩種物質之間可以建立靜電相互作用。由於大多數細菌表面都帶負電荷，所以帶正電荷的接觸表面將有利於生物膜的形成。然而，在實際情況下，接觸面也可能暴露在由離子和小分子組成的高離子介質中，這些離子和小分子通過擴散和傳質過程吸附在接觸面上，從而改變接觸面性質。接觸面和細菌細胞之間的相互作用也隨之被改變，並建立起靜電相互作用。當微生物細胞通過靜電相互作用吸附到表面時，細胞與接觸面之間的距離縮短。

當接觸面的非極性和低表面能疏水基團與細菌細胞相互作用後，由於接觸界面的疏水性有改變的趨勢，細胞在表面的黏附能力也受此改變。Davidson和Lowe發現接觸表面的疏水基團有利於生物膜的形成和穩定。然而，Heistad等卻給出了不同的觀點，他認為界面疏水性與生物膜的形成沒有明顯的關係。研究還發現，與不鏽鋼相比，C. sakazakii 細胞更容易附著在矽膠和聚碳酸酯上（P<0.05），且親水性材料似乎更有利於C. sakazakii 生物膜的形成。因此，C. sakazakii 生物膜形成與界面疏水性之間是否存在關聯性是一個具有爭議的問題，對該菌的黏附性仍需更多的研究去確證其相關性。

此外，表面粗糙度可降低液體流動相中細胞的水力剪切力。因此，表面粗糙度將保護細菌細胞不被水流清除，並增強細胞的初始黏附力。然而，不同細菌的細胞顆粒大小存在較大差異，從而會導致不同細菌的最佳接觸表面粗糙度。

（二）細胞自我調節

1. 群體感應

在大多數環境中，生物膜以混合種群而非單一物種的形式存在。這種生存模式賦予其具有區別單一物種的特有生理功能。生物膜內物種的種間調節機制主要是群體感應（quorum sensing, QS）。這種QS系統會產生一種稱為「自誘導物」（autoinducer, AI）的低分子量信號分子，它根據周圍環境中的細菌數量啟動自身表達。當生物膜中的細菌數量增長到一個感應閾值濃度時，細菌釋放信號分子用以改變和協調其生理活動。QS系統監管細菌中營養物質的運輸和代謝終產物的去除等相關基因表達的變化。這種調控行為可以降低由於細菌過度生長而導致的空間和營養的缺乏，從而促進生物膜的形成。

革蘭氏陰性細菌主要利用N-醯基-L-高絲氨酸內酯（N-acyl-L-homoserine lactones, AHL）進行相互交流，而這些細菌傳遞信息的物質通常是幾種AHL的混合物（圖2）。群體感應通路通常包含兩個重要的蛋白質（LuxI和LuxR），它們分別在自誘導物的合成和識別中起關鍵作用。LuxI是一種可以在細胞內外自由擴散，誘導合成QS自誘導物AHL及其衍生物的合成酶。隨著細菌密度的增加，當AHL濃度達到臨界值時，AHL與LuxR結合，並激活下遊基因的表達，從而改變其對周圍環境的生理反應。AHL一般由一個含4~18個碳的乙醯基鏈尾部與一個保守的高絲氨酸內酯頭部組成，其主要區別取決於醯基側鏈的長度、飽和度及C3位的取代基。目前，已有研究表明C. sakazakii 可分泌3種信號分子（N-庚烷基-AHL、N-十二烷基-AHL和N-十四烷基-AHL）。Lehner等表示Cronobacter 可通過表達群體感應信號分子AHL調控生物膜的形成，並用薄層色譜法發現了兩種不同類型的AHL——3-oxo-C6-AHL和3-oxo-C8-AHL。研究者採用高效液相色譜-串聯質譜法聯用技術檢測AHL，結果表明C6~C18長鏈AHL的表達顯著。此外，液相色譜-高解析度質譜儀也在C. sakazakii 成膜菌株中鑑定到N-十一烷基-L-AHL、N-十二烷基-L-AHL、N-十四烷基-L-AHL、N-十五烷基-L-AHL、N-（β-乙醯酮）-L -AHL、N-辛醯基-L-AHL、N -3-oxo-辛醯基-L-AHL和N -十八醯基-L-AHL的存在。

圖2 革蘭氏陰性菌中AHL介導QS的簡化圖。革蘭氏陰性菌具有兩種調節成分：LuxI和LuxR。LuxI是AHL生物合成所必需的，LuxR編碼AHL結合蛋白。一旦達到閾值濃度，AHL將自由進入鄰近細胞。由LuxR和AHL組成的複合物將激活下遊基因的表達。生物膜的形成隨後受到AHL介導的QS調控的靶基因的影響

未來更多的研究應該集中在QS系統介導的C. sakazakii 生物膜形成和發展調控機制研究。這將為探索基於QS控制致病菌生物膜提供新策略。

2. 細胞的遺傳元素和理化性質

生物膜中的微生物被其胞外高分子基質所包裹。胞外多聚物（extracellular polymeric substance, EPS）主要由細胞外多糖、蛋白質及細胞外DNA和基質組成，且該基質介導細胞在介質表面的黏附和細胞的集結（圖3）。這些基質填充了細菌之間的空隙，構成良好的機械穩定性。由於這種結構穩定性，生物膜中的微生物獲得很高的存活率和持久性。不同胞外聚合物組分的濃度、黏性、電荷和吸收能力，以及基質的密度、孔徑和通道都決定了生物膜的異質性。因此，生物膜會呈現出各種形態學特徵，如光滑、扁平、粗糙、蓬鬆或絲狀，甚至形成像蘑菇狀的水包圍的團塊。

圖3 革蘭氏陰性菌生物膜的基本成分

最近，研究人員通過比較蛋白組方法研究了Cronobacter 的生物膜相和浮遊相的差異蛋白，並證實了其差異表達蛋白大多富集在鞭毛、纖維素合成、胺基酸代謝和碳水化合物的代謝途徑中。Cronobacter 莢膜由O抗原、K抗原、膽汁酸、纖維素和腸道菌共性抗原組成。這些組分的比例可能會隨著生長條件的變化而變化，但目前還沒有關於Cronobacter莢膜的研究。有報導發現，特定的莢膜型別與新生兒腦膜炎病例有一定的關聯性，因此這一領域需要被更多的關注。此外，細菌產生的纖維素通常是細胞外的一種成分，它能給細胞提供機械和化學保護以抵禦不利環境。纖維素也是生物膜的一個結構成分，它形成了具有強水吸附能力的水凝膠。纖維素是由BcsA和BcsB組成的纖維素合成酶複合物合成和分泌的。其中，bcsA 編碼纖維素合成酶催化亞單位，bcsB編碼磷酸鳥苷環二聚體（cyclic dimeric guanosine monophosphate, c-di-GMP）結合蛋白。纖維素的生物合成和調控需要兩個遺傳元件，分別為bcsABZC和bcsEFG操作子（圖4）。由9個基因（bcsGFERQABZC）組成的纖維素基因簇幾乎在所有的C. sakazakii菌株中都存在。Hu等對臨床、食品和環境中分離出的菌株中纖維素合成酶相關基因的分布情況進行比較。結果表明，所有臨床分離株中和大部分的食品、環境分離株可檢出纖維素合成酶操縱子（bcsABZC）。此外，與親代菌株相比，bcsA 和bcsB 的缺失會導致生物膜形成能力和細胞凝集力顯著降低，並且bcsA 和bcsB 突變體不產生纖維素。BcsR對C. sakazakii 纖維素合成有負調控作用，但對其生物膜形成、黏附和侵襲均有正調控作用。通過反轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）也驗證了在ΔbcsR突變株中纖維素合成關鍵基因（bcsA,B,C,E,Q）比野生株表達上調及鞭毛合成基因（fliA,C,D）、毒理基因（ompA,ompX,hfq）表達下調的現象。這些基因中，ΔbcsR 突變株中和ompA 表達量下調更顯著。同時，研究者又通過拉曼光譜分析發現，在bcsR敲除後，類胡蘿蔔素、脂肪酸和醯胺等生物膜成分也顯著降低。

此外，細菌胞外細胞器（鞭毛、纖毛、菌毛等）有助於克服靜電排斥並增強載體界面上的細菌積累。通過對Cronobacter比較基因組分析，確定了10個假定的菌毛基因簇。特別的是，編碼β-菌毛的基因簇是C. sakazakii 特有的，而其他6個菌種的基因組編碼捲曲菌毛。捲曲纖維是一種薄的、捲曲的、高度聚集的澱粉樣纖維無定形的基質。它們參與了細胞褶皺、聚集、黏附、生物膜形成和環境持留。由於C. sakazakii 感染途徑可能是通過腸道細胞的附著和侵襲，所以該菌菌毛除了對生物膜的形成具有重要意義外，其在致病性方面也具有深遠影響。Hartmann等也同樣發現，在其研究的C. sakazakii 標準菌株和分離株中捲曲菌毛相關的基因也出現缺失現象。由於C. sakazakii 是該屬臨床分離株的優勢菌種，因此可以推斷捲曲菌毛並非Cronobacter 致病所必須的細胞器官。捲曲菌毛可與纖維素一起形成蜂窩狀結構，促進生物膜的構建。捲曲菌毛的生物合成和組裝分別由兩個轉錄操作子csgDEFG 和csgBA 編碼。csgBA 操作子編碼捲曲結構主要的亞單位CsgA和細胞核蛋白CsgB。Hu在180株C. sakazakii 中檢測與此纖維合成相關的遺傳元件，結果發現，在所有的C. sakazakii 菌株中均無csgA和csgG 基因。此外，csgBAC 和csgDEFG 操作子在C. sakazakii 菌株中也是缺失存在。儘管如此，csgA 和csgB 對除了C. sakazakii 和 C. muytjensii 之外的Cronobacter 其他菌種的捲曲菌毛、生物膜形成和細胞聚集都有積極的調控作用。因此，C. sakazakii 可能通過表達其他途徑中的不同蛋白質調控生物膜形成和細胞聚集，使其產生與捲曲菌毛相似的生理功能。

運動性通常能賦予細胞具有從附著表面駛向更適合生長區域的能力，而運動力往往被認為與生物膜的形成密切相關。浮遊態細胞因其有旋轉鞭毛而具有運動性能（圖4）。FlhA和FliG蛋白構成了鞭毛基體，而FlhA的缺失會導致鞭毛成分的缺失。FliG與FliN和FliM一起構成基體的C環。位於鞭毛基部的發動機（MotA和MotB蛋白）利用質子動力加強螺旋纖維的旋轉以推動細胞至不同的環境。ΔflhA、ΔfliG、ΔfliC和突變株細胞無鞭毛並喪失自凝能力，相反地，ΔmotAB和ΔflhA突變株仍保留鞭毛結構和自凝性。具有運動性，而ΔmotAB 已不具有運動性。另外，FliC並非介導了C. sakazakii 在PVC上的成膜性。研究人員認為，運動性和基質合成通常是相反的，且同步地被調控。然而，通過對C. sakazakii鞭毛缺失突變體和一些調控基因的研究發現，運動性與生物膜之間的關係是具有菌株特異性的。此外，鞭毛是否對生物膜的形成有積極或消極作用的論題仍存在爭議，而非動力因素也可能影響生物膜的發育。

圖4 阪崎克羅諾桿菌生物膜形成調控網絡

近些年，高通量的功能基因組學得到了長足發展，微生物種群的研究範圍大大提升。高解析度的DNA測序技術對於探索不同環境的微生物群落組成和功能具有重要的價值。代謝組學是一個不斷發展的研究領域，它不僅可以發現生物標記還能夠更好地揭示表型形成機制。多組學數據技術（如轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學）的聯合應用可以系統性地捕捉微生物群落的結構、功能輪廓。由於信息學和分析技術的創新發展， 「多組學」方法將為微生物生理學提供新的見解。目前，大型組學數據集的生物信息學分析可以應用於揭示與表型特徵相關的調控途徑及關鍵靶標。隨後，利用反向遺傳學技術直接改變特定的DNA區域，即可驗證這些變化對生理現象的影響。因此，這些技術將有助於加深理解細菌生物膜的形成機制，包括它們的形成和分散過程（圖5）。

圖5 生物膜研究中的多種組學方法。GWAS：全基因組關聯分析；MWAS：宏基因組關聯性分析；RNA-seq：RNA測序（包括mRNA、小RNA、lncRNA和circRNA）；ChIP-seq：染色質免疫沉澱測序；iTRAQ：同位素標記相對和絕對定量；SWATH：按窗口順序採集所有理論質譜譜圖

三、生物膜的清除與防控

Cronobacter可以從各種惰性和生物活性表面分離得到，並在食品工業中廣泛存在。據報導，這種細菌可以從生產環境中檢出，且特定的菌株可以在工廠裡存活幾個月，甚至幾年。由於人們常用PIF和幼兒奶粉（follow-up-formula, FUF）餵養嬰幼兒，因此降低這些奶粉中的Cronobacter 汙染已成為人們關注的焦點。一般情況下，PIF餵養不超過12個月大的嬰兒；FUF是6個月以上的嬰兒和12個月以上至3歲的幼兒的斷奶食品。這類產品在生產過程中會經過高溫和乾燥處理環節，這些處理有助於保障產品的微生物安全。然而，在儲存和包裝的後處理過程中，如滾筒乾燥機、包裝機、乾燥塔和空氣過濾器這些設備也會受到C. sakazakii 的汙染（圖6）。因此，在生產過程中細菌的生存將受到各種各樣的挑戰。生物膜的形成是細菌抵禦外界應力的重要策略，生物膜對其的保護作用不容忽視。研究表明，生物膜態的Cronobacter 細胞比浮遊態細胞對清潔劑和消毒劑具有更高的耐藥性，這就是個很好的證據。目前，控制和消除乳製品/食品加工設備中的生物膜仍是一個挑戰。

圖6 生物膜的常見定殖區和在PIF加工過程中潛在的生物膜處理方法。ⅰ. 塗層；ⅱ. 益生元產品；ⅲ. 噬菌體；ⅳ. 天然提取物（包括基於天然提取物的信號阻斷）；ⅴ. 超聲波清洗；ⅵ. 基於納米技術的遞送系統；ⅶ. 消毒劑

（一）原位清洗系統

在食品生產過程中，清潔是減輕微生物附著在接觸面上的一個極其重要的過程。目前，原位清洗（clean in place, CIP）系統已逐步取代人工清洗。在此系統中，生產設備無需拆卸即可進行自動或半自動清洗，洗滌劑溶液通過壓力或質量流量噴到設備上。這種方法現已被廣泛應用於食品生產工廠的各個階段。

Bremer等研究了CIP在乳品工業中去除不鏽鋼表面生物膜的效果。他們提出，標準CIP系統並非總能確保細菌生物膜的去除，而改變CIP條件可以增強乳品加工廠內生物膜的去除。影響CIP清潔效果的因素有清洗溫度、時間、化學成分、濃度、表面特性和生物膜層。Kumari和Sarkar在實驗室模擬蠟樣芽孢桿菌在乳製品冷藏槽中形成生物膜，以優化其CIP體系。標準CIP可達到每平方釐米3.29 log的減少量，而通過改變藥劑濃度和CIP工藝處理時間得到優化後的CIP將達到每平方釐米4.77 log的清除量。優化CIP系統不僅可以提高食品安全，而且還可改善產品質量、設備性能，並具有良好的經濟效益。然而，目前對於控制乳業中C. sakazakii 生物膜的CIP優化體系還知之甚少。

（二）物理處理

通常，用於去除細菌生物膜的物理方法包括機械法、超聲波法和電學法。設備的設計和表面材料的選擇對防止生物膜的形成起著關鍵的作用。目前，銅合金廣泛應用於食品加工工業中，其對細菌（尤其是抗銅離子的細菌）具有抑制作用。銅合金可以從表面釋放銅離子，改變細菌細胞膜的通透性，導致銅進入細胞，進而損傷鐵硫蛋白。Elguindi等發現，懸浮於胰酶大豆肉湯中的C. sakazakii 細胞在溼的99.9%銅合金上會在10 min內被殺死，且在乾燥的99.9%銅合金上1 min內得以死亡。結果表明，在食品加工乾燥過程中應用銅可以有效地在包裝前、包裝中及包裝後的儲存中殺滅C. sakazakii。

Cronobacter對乾燥具有高度耐受能力，能在PIF中存活兩年以上。然而，它不是產孢菌，因此對熱脅迫並未有較強的抵抗力。Nazarowec-White和Farber測定了一個含有10株克羅諾桿菌（5株臨床分離株和5株食品分離株）混池的D值。結果顯示，該混池52 ℃、54 ℃、56 ℃、58 ℃和60 ℃的D值分別為54.8 min、23.7 min、10.3 min、4.2 min和2.5 min；z 值為5.82 ℃。此外，Iversen等比較了Cronobacter 標準菌株和莢膜菌株的耐熱性。但由於結果的標準差較大，所以標準菌株和莢膜菌株的D 值和z 值均無統計學差異。研究者還測定了54 ~ 62 ℃下PIF中懸浮細胞的D值。54 ℃時D值為10.2 ~ 16.4 min，62 ℃時D 值為0.2 ~ 0.4 min；z值 為5.7 ℃。Awadallah等發 現，Cronobacter菌株具有耐熱性，在64 ℃下該菌的D值為13.79 min；z值為14.42 ℃。而Ueda則發現，60 ℃以上Cronobacter 菌株可在2 ~ 5 min內完全失活。

因此，聯合國糧食及農業組織（The Food and Agriculture Organization, FAO）和世界衛生組織（World Health Organization, WHO）提出，PIF應在>70 ℃的溫度下衝泡，並在殘留菌株繁殖到顯著水平之前立即使用。然而，在食品加工過程中，熱休克往往可能會誘導細菌的保護機制，使機體能夠在噴霧乾燥處理後存活。

CIP常採用的另一種消毒方法是電磁波輻射。電磁波法是通過破壞或改變生物大分子的結構來實現細菌失活的方法。Mahmoud研究X射線照射Cronobacter 後該菌的生存能力變化。結果表明，5.0 kGy的X射線處理後，Cronobacter 在脫脂牛奶和含有1%脂肪的奶粉中存活率均顯著（P < 0.05）降低至檢測限以下（<1 log CFU·mL^–1 ）。此外，紫外線（UV-C）（200~280 nm）、酸性電解水和中性電解水在微生物控制中應用也較多，其中，UV-C光照對C. sakazakii的殺滅效果更好。使用7.5 kJ·m^–2和10 kJ·m^–2劑量的UV-C後，活菌數分別減少2 log CFU·g^–1和2.4 log CFU·g^–1。近紅外（near-infrared, NIR）加熱與紫外輻射聯合處理C. sakazakii 7 min後表現出較強的協同殺菌能力，菌體CFU降低2.79-log-unit，這種協同作用主要破壞細菌細胞膜。儘管在乳製品工業中，輻照是一種有效和安全的去除C. sakazakii的替代技術，但維生素和脂類物質對輻照很敏感，輻照可能會導致維生素和脂類的減少，從而導致營養成分的損失。食物種類、輻照劑量、溫度、含氧量、維生素種類等都會對輻照後的維生素損失產生不同程度的影響。從營養的最大化和食品安全與健康平衡的角度出發，我們需要開發和改進更為先進的綠色殺菌技術。

與傳統的擦拭方法相比，超聲是一種更有效的生物膜去除方法。然而，單獨應用這項技術不能完全消滅細菌，因此多種方法的聯合使用應運而生。Adekunte等對接種C. sakazakii 的PIF在高溫和超聲協同作用下進行細菌滅活性比較，結果表明，兩者聯合使用可顯著降低C. sakazakii的活性。壓力超聲波（manosonication, MS）是在壓力下進行超聲波，其通過空化強度對細菌起到致死作用。C. sakazakii 在標準處理下（35 ℃，117 μm，200 kPa，磷酸檸檬酸緩衝液pH 7.0）的D值是0.41 min，這個結果高於小腸結腸炎耶爾森氏菌（D=0.19 min），並低於腸炎沙門氏菌（D= 0.61 min）、單核細胞增多性李斯特氏菌（D = 0.86 min）和屎腸球菌（D = 1.2 min）。

物理處理無疑是主要的生物膜控制策略之一，但它可能無法完全去除生物膜，並且不適用於食品加工的所有階段。因此，需要化學或生物控制方法來補充或配合物理處理。

（三）化學處理

1. 殺菌劑

對高效、安全的抗菌物質的研發往往希望效益高、對環境無汙染、無殘留、經濟效益高。Kim等比較了13種消毒劑處理後，Cronobacter 在懸浮液和不鏽鋼表面乾燥的生物膜中的存活情況。這些消毒劑的選擇參考其在醫院、日託中心和食品服務廚房的使用情況。季銨鹽類化合物和過氧乙酸/過氧化氫相關消毒劑對Cronobacter 生物膜的殺滅效果較好。在濃度為400 mg·L^–1 的苯扎氯銨、過氧乙酸和二氧化氯15 min處理條件下，活菌數分別減少了69%、73%和51%。然而，使用結晶紫測定生物膜量時發現，這些處理僅對18%的生物膜生物量產生抑制作用。雖然這些殺菌劑在食品安全中發揮著重要作用，但值得注意的是，過量使用殺菌劑可能會產生耐藥性菌株，從而對臨床重要藥物產生交叉耐藥。目前，細菌耐藥性是一個全球共性問題，它制約著臨床治療的有效性。

2. 植物提取物

傳統的消毒方法對生物膜並非完全有效，反而可能會誘導抗性表型的改變。因此，有必要進一步開發和應用無化學殘留的綠色（或生態友好型）殺菌劑。目前，很多研究正在評估從植物中提取的天然化合物在消除生物膜方面的潛力。這些天然化合物具有穿透細菌生物膜的能力，在環境中很容易降解，而且幾乎無毒。

反式肉桂醛（trans-cinnamaldehyde, TC）是從肉桂皮提取的一種成分，也是肉桂油的原料，它是美國食品和藥品監督管理局（Food and Drug Administration, FDA）批准的食品級物質。Amalaradjou和Venkitanarayanan研究了TC對附著在聚苯乙烯板、不鏽鋼片、哺乳瓶片、腸內給料管片表面上的生物膜的抑制作用。結果發現，TC可以滅活附著在以上所有檢測基質上的C. sakazakii 生物膜。當C. sakazakii在38 mmol·L^–1 和750 μmol·L^–1 TC中處理96 h後，其存活量分別減少了超過4.0 log CFU·mL^–1 和3.0 log CFU·mL^–1 。此外，TC還能顯著抑制C. sakazakii 生物膜和毒力相關基因的表達，這些基因對其活力、宿主組織的黏附和侵襲、巨噬細胞的存活以及脂多糖的合成至關重要。因此，TC處理後，C. sakazakii 對腸上皮細胞、腦微血管內皮細胞的黏附和侵襲受到明顯抑制（P≤0.05），並且其在人巨噬細胞中存活率也有所降低，並降低C. sakazakii 自身的存活。

多酚對人體健康非常有益，可以增強血管壁、促進胃腸消化、降低血脂、抑制細菌和癌細胞的增殖，並具有抗氧化活性可以清除對人體健康有害的自由基。近期，已證明圓葉葡萄種子提取物對Cronobacter具有一個高水平的殺滅能力，其在1 h可將大約6 log CFU·mL^–1 的原始菌量降低到無法檢測的水平（最低檢出限，10 CFU·mL^–1 ）。極性酚和多酚可能為圓葉葡萄種子提取物的主要抗菌成分。藍莓汁和藍莓多酚也可抑制C. sakazakii。分別用藍莓汁（pH 2.8）或藍莓原花青素處理C. sakazakii1 h，菌量從大約8.30 log CFU·mL^–1 降至無法檢測的水平。

3. 抗菌肽

抗菌肽（antimicrobial peptide, AMP）是一種天然免疫系統分子，並作為抵抗病原體入侵的第一道防線。這些天然蛋白廣泛存在於包括動物、植物、昆蟲和細菌的各種生物體中。天然AMP通常比較短，由12~100個胺基酸組成。AMP基於其二級結構可以分為4種類型：β摺疊、α螺旋、環狀和伸展性肽，其中前兩類是自然界中最常見的。化學防腐劑的過度使用導致細菌產生耐藥性，而傳統的食品保鮮方法已不能滿足食品安全的要求。

近年來，AMP作為天然生物防腐劑被應用於提高食品的貨架期。許多研究人員表示，AMP可對多種食源性致病菌均表現出抑制作用，且不改變其食物特性，並對人體無危害性。在解決細菌生物膜引起的持續汙染研究中，AMP被認為是傳統抗生素的潛在替代品。AMP能在生物膜形成的不同形成階段與其對抗。細菌的清除是由於抗菌肽的滲透或其在細胞膜表面形成小孔來實現的。此外，AMP還能抑制細胞壁、核酸和蛋白質的生物合成。人類抗菌肽LL-37能夠破壞表皮葡萄球菌生物膜的發育。LL-37顯著降低細菌對表面的附著，且該抗菌肽在不能殺死或抑制其浮遊細菌生長的濃度下也能顯著減少其生物膜量，說明肽對生物膜產生了直接作用。除此之外，AMP還被認為促發細菌的運動，並下調生物膜發育相關基因的表達。

許多天然、半合成和合成的AMP已被證明均對微生物生物膜具有抗性。生物膜有效AMP (biofilm-active AMP, BaAMP)是一個收集了針對微生物生物膜有作用的AMP資料庫。該資料庫中的AMP可為生物膜形成過程的幹預提供參考。靶向Cronobacter 生物膜的AMP的優化以及發掘和合成新的肽段是非常必要的。BaAMP可以通過http://www.baamps.it免費訪問。AMP的設計方法有很多，但合成抗菌肽在食品中的應用必須注意該物質的食用安全性。

（四）生物過程

微生物多種種間相互作用和產生的代謝產物會干擾生物膜的形成和發育。下面討論兩種最常用的通過微生物-微生物相互作用來消滅細菌及其衍生物的方法。

1. 益生菌產品

克非爾（kefir）是一種對C. sakazakii 具有抗菌活性的益生菌乳製品。從kefir中分離的乳酸菌上清液中發現，Lactobacillus kefiri DH5和L. kefiranofaciensDH101這兩種菌株對C. sakazakiiATCC 29544的增殖有明顯的抑制作用。L. kefiriDH5可破壞C.sakazakii 的細胞膜完整性，因此其對該菌具有較高的滅活性。Awaisheh等研究了乳酸菌對不同C. sakazakii 的抗菌活性，發現從健康嬰兒中分離的益生乳酸菌所產生的細菌素可以抑制C.sakazakii 。然而，這些細菌素由於其低耐熱性而不能用於工業生產中。因此，在PIF中添加益生菌產品不僅能促進嬰幼兒的健康成長，還能抑預防C. sakazakii 的潛在汙染。

2. 噬菌體

利用噬菌體來控制生物膜是一種可行的、自然的、無害的、特異的方法。例如，QS信號分子AI-2的加入可以誘導原噬菌體，並促進了糞腸桿菌生物膜中的細菌解散。ListShield (Intralytix, Inc., USA)是於2006年由FDA批准的第一個用於食品安全的噬菌體產品，從而確認噬菌體可作為一種食品中的安全添加劑。至此以後，越來越多的噬菌體產品被批准作為食品微生物控制劑。這些進展突出了噬菌體在控制食源性致病菌和腐敗微生物方面的潛力。

與傳統抗生素治療相比，噬菌體相關的控制方法具有以下優點。

（1）安全性高：特異性噬菌體不會感染哺乳動物細胞。

（2）易獲取：噬菌體在環境中普遍存在，因此相對容易獲取。

（3）特異性強：靶向致病菌的特異性噬菌體將不幹擾人體其他正常菌群和食物基質固有菌群。

為了保證PIF的安全性，雀巢公司提出了一種無毒的溶菌噬菌體，以減少Cronobacter的汙染。Endersen等的研究發現，其測試的噬菌體雞尾酒的宿主範圍相對較廣，覆蓋了研究中73% C. sakazakii 菌株。噬菌體混合（3×10⁸CFU·mL^–1 ）可顯著降低C. sakazakii存活率，使其從 10⁴CFU·mL^–1 降至低於檢測限（<10 CFU·mL^–1 ）。當細菌在噬菌體雞尾酒處理48 h後，其生物膜的形成也受到了抑制。由於噬菌體可在4 ~37 ℃、pH值範圍為6 ~ 8的條件下增殖，且所有噬菌體都不具有溶原性，因此這些噬菌體具有潛在治療應用價值。這些研究均表明噬菌體在PIF中C. sakazakii汙染的生物控制以及預防該菌生物膜形成方面的潛在應用。

（五）潛在方法

1. 納米技術

近些年，納米材料及其技術的快速發展為開發控制微生物生物膜的抗菌劑提供了新策略。納米銀、二氧化鈦、氧化銅等納米材料都具有良好的抗菌活性。這些納米粒子具有高穩定性、殺菌劑耐受性、低毒、比表面積高等特性，這些特性賦予納米粒子具有與細菌相互作用更有效的位點。這些材料作為設備塗層可以有效地控制食品加工過程中細菌的生長。

基於納米技術的傳遞系統也是增強材料抗生物膜活性的重要手段。針對生物膜的殺菌劑效果通常由於其無法很好地滲透進生物膜基質而受到限制。然而，基於納米技術的藥物傳遞系統可以使納米顆粒和微生物膜相互作用，進而藥物直接作用生物膜的複雜結構。目前，用於傳遞生物活性物質的納米載體主要有脂質體（liposome, LIP）、微乳液、納米乳液、環糊精、固體脂質納米顆粒、聚合物納米顆粒和金屬納米顆粒。Robinson等比較了帶有陽離子和陰離子的LIP負載疏水性殺菌劑三氯生（triclosan, TCS）對殺菌效果的影響，TCS是一種高效的烯醯-ACP還原酶抑制劑。陰離子脂質體對S. sanguis 純菌生物膜有較強的傳遞殺菌物質的效果，且該脂質體-三氯生體系具有更高的殺菌效果。而陽離子脂質體-三氯生傳遞系統只能抑制S. sanguisC104生物膜的生長，對混合菌群的生物膜無明顯抑制作用。這些發現證明了靜電相互作用對抗菌劑傳遞的重要性。

納米酶被定義為具有類酶活性的納米材料，可以在生理條件下催化天然酶底物產生類似的反應動力學行為。這些材料基於納米酶中氧化酶和過氧化物酶的活性能夠催化產生自由基，破壞細胞膜的完整性，降解核酸，使各種蛋白質失活，最終導致細菌死亡。此外，天然酶的天然催化活性很容易受到周圍環境的影響或抑制且易被蛋白酶消化，而人工酶可以克服天然酶的缺點。Tao等構建了具有過氧化物酶和氧化酶雙重酶活性的介孔二氧化矽負載金納米顆粒（mesoporous silica supported gold nanoparticle, MSN-AuNP）抗菌體系。MSN-AuNP引發的類過氧化物酶活性可以催化H₂O₂ 分解為•OH，且其類氧化酶活性可以生成ROS。MSN-AuNP具有顯著的酶活性，對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均表現出良好的抗菌能力和生物膜清除能力。具有類過氧化物酶活性的鐵磁性納米粒子（Fe₃O₄, MNP）可以催化過氧化氫的降解，從而有效降解DNA、蛋白質和多糖等生物分子。此外，Fe₃O₄、MNP可以增強H₂O₂ 清除生物膜的作用。H₂O₂ 單獨處理生物膜後，生物膜殘留率為49% ± 7.37%，而MNP-H₂O₂ 處理後，生物膜殘留達18% ± 6.17% 。這一差異表明MNP- H₂O₂ 比H₂O₂ 更能有效地降低細菌的活力。

2. 信號阻抑

群體感應是調節生物膜群落髮展和穩態的機制之一。因此，研究者開發群體感應抑制劑（quorum sensing inhibition, QSI）以幹預群體感應的調控行為，如細胞黏附和細胞外聚合物的分泌。因此，群體感應療法通常通過調節細菌間的交流使細胞喪失某些功能。

QS的過程可以被不同的機制破壞：①抑制QS信號分子的合成；②降解QS信號分子；③降低QS信號分子的活性；④設計信號分子的類似物，從而競爭性地與受體蛋白結合。

在QS抑制方法中，降解信號分子和抑制AHL合成是目前比較具有潛力的生物膜控制方法。Singh等研究了9種植物提取物（黑胡椒、肉桂、芫荽、孜然、大蒜、肉豆蔻、生薑、丁香和葫蘆巴）對C. sakazakii 菌株QS介導的生物膜的抑制作用。利用生物指示物青紫色素桿菌026和根癌土壤桿菌NTL4 （pZLR4）測定在9種植物提取物對QS產物的影響，研究表明100 ppm的胡椒和肉桂分別導致QS產量下降78%和68%。並且，這兩種提取物對C. sakazakii 生物膜的形成均表現出較高的抑制作用（>50%），而其他提取物對生物膜的抑制作用為中等（25%~50%）和較低（<25%）。該研究重點研究了黑胡椒和肉桂的抗群體感應，以抑制C. sakazakii 生物膜形成的潛在能力，為進一步探索新的生物活性分子奠定基礎。當然，其他植物提取物對QS的破壞方面的研究也仍需加強探究。

四、食品加工廠中 Cronobacterspp.生物膜防控的建議

嬰幼兒配方奶粉之所以受Cronobacterspp.汙染，可能與其生產環境、原料和工廠人員的傳播有關。其中，儲存罐、設備和操作室通常是微生物最易儲藏的場所（圖6）。工廠內的「死角」（如裂縫、角落、接縫和墊）往往是生物膜在清洗後仍可殘留的區域。除了生物膜易殘留的設備外，過濾和集水區的氣溶膠顆粒也會引起細菌的滯留，從而形成生物膜。鑑於不同器具的實際應用和操作需要（機器的大小、質地、功能等），食品生產設施中的細菌不能僅僅用一種方法消滅，因此建議採用多種技術相結合用於殺菌。其中，材料表面改性是防止微生物黏附和隨後生物膜形成的一種非常實用的方法。當解決食品環境中生物膜的生態複雜性時，這些策略可能會展現出進一步的潛力。因此，對生物膜形成機制的清晰認識，對於實現一種新穎、實用、經濟和環境友好的策略以確保食品安全具有至關重要的作用。

五、結論與展望

高通量DNA測序技術極大地促進了對生物膜形成的分子機制的全面了解。應用各種手段可以大大減少生物膜的形成。特別是，接觸材料的改性可幹擾生物膜形成的各個階段，從而達到生物膜的預防和控制。在抗菌物質和材料聯合作用方面，最受歡迎和最有效的策略是表面塗層法，這是一種可直接靶向生物膜汙染位點的方法。此外，由於受損的QS系統會進一步影響細胞附著、微生物基質分泌以及對其感染和致病性的預防，因此QS信號阻斷化合物也是很有前景的研究方向。

自20世紀80年代中期首次正式定義生物膜這個概念以來，我們對生物膜的探索有了長足的進步。然而，Cronobacterspp.生物膜形成的相關研究仍處於起步階段，在未來的研究中可將生物化學、細胞、分子和遺傳學等相結合探究克羅諾桿菌生物膜的分子機制和功能。

以下科學問題可能需要進一步思考和探究。

（1）C. sakazakii菌毛合成特異分子的機制是什麼？菌毛如何影響生物膜形成？

（2）C. sakazakii 生物膜抵抗極端乾燥環境的機制是什麼？

（3）乾燥處理是否改變C. sakazakii 生物膜的組成成分，從而使其具有強抗乾燥能力，其他細菌是否有相同的作用機制？

（4）研究表明，引發新生兒患腦膜炎的C. sakazakii 致病菌株與K2:CA2型莢膜密切相關。該型別的莢膜成分是否能有利於該菌在嬰幼兒配方奶粉和胃中持留？

（5）在生物膜內Cronobacterspp.如何與其他物種進行交流？不同種類的細菌之間是否存在共用的群體感應機制？

註：本文內容呈現略有調整，若需可查看原文。

改編原文：

Na Ling, Stephen Forsythe, Qingping Wu, Yu Ding, Jumei Zhang, Haiyan Zeng.Insights into Cronobacter sakazakii Biofilm Formation and Control Strategies in the Food Industry[J].Engineering,2020,6(4):393-405.

作者介紹

吳清平，食品安全科學技術專家，中國工程院院士。

針對我國食品行業出現嚴重的微生物安全風險，從基礎研究著手，發明先進的共性監控技術並建立起相關理論體系，研製出重點產業食品安全控制技術和與國際接軌的先進標準，解決了食品安全中的重要科學問題和關鍵技術難題，顯著推動我國食品安全科學理論不斷提升和產業健康發展。

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註：論文反映的是研究成果進展，不代表《中國工程科學》雜誌社的觀點。