腸道微生物在宿主健康中起著重要的作用，與很多疾病（如癌症、糖尿病、肥胖、神經發育障礙等）的發生發展有密切的關係，寄主和共生腸道微生物在食物和異物物質的代謝過程中共同產生大量的代謝物。腸道微生物的種類以及功能的不同會對存在於宿主的體液以及組織中的小分子代謝物的種類和數量產生重要的影響。
本篇是由武漢大學馮鈺錡教授課題組在Analytical Chemistry上發表的「Comprehensive Profiling of Fecal Metabolome of Mice by Integrated Chemical Isotope Labeling-Mass Spectrometry Analysis」文章。在本文中，作者通過集成化學同位素標記與液相色譜-質譜聯用技術（LC-MS代謝組學）重點對糞便樣本中含有羧基、羰基、胺基以及巰基的代謝物進行了系統性的分析研究，建立了小鼠糞便代謝組學資料庫。
中文標題：使用同位素標記的方法全面地分析糞便樣本中的代謝物研究對象：雙轉基因小鼠糞便發表期刊：Analytical Chemistry影響因子：6.785運用生物技術：LC-MS代謝組學
研究背景
哺乳動物體內有多種代謝活躍的腸道菌群。宿主和腸道菌群之間的動態串擾對維持宿主體內平衡至關重要。哺乳動物體內有多種代謝活躍的腸道菌群。阿爾茨海默病（AD）是一種以認知功能逐漸衰退為特徵的神經退行性疾病。越來越多的證據表明，各種途徑的代謝紊亂可能介導阿爾茨海默病病理的發生和患者認知功能障礙的發生，腸道微生物群與AD的關係尚不清楚。本文通過化學同位素標記結合液相色譜-質譜聯用（LC-MS代謝組學）技術對小鼠糞便代謝組分進行了綜合分析，為更好地了解腸道微生物群宿主彗星菌群的變異對AD的影響，將有助於制定預防和治療AD的新策略。
研究思路
研究方法
1.實驗分組
以表達人突變型APPK670N/M671N 25和突變型psm146l26的APP/PS1雙轉基因28隻小鼠C57BL/6J（C57）為AD模型和40隻野生型（WT）C57BL/6J小鼠，分別飼養在光照控制室（光照和黑暗12小時）23℃下，自由進食標準食物和水。
通過從所有68隻小鼠（混合樣本A）、40隻WT小鼠（混合樣本B）或28隻AD小鼠（混合樣本C）中取等量的每個糞便樣本製備混合樣本。每組製備三份獨立的混合樣本，並進行三次測量。
2.實驗流程
圖1 | 小鼠糞便代謝物相對定量方法
Pooled A為所有樣本的混合物，分別與同位素標記和未標記的反應試劑反應，用於提取目標離子和獲取碎片信息。
3.反應試劑的合成
合成同位素標記的反應試劑，用於特異性地與代謝物中的羧基、羰基、胺和巰基進行反應，化合物的結構以及與代謝物反應的過程如下圖所示：
圖2 | 同位素標記試劑與帶有不同官能團的代謝物之間的化學反應
由於反應試劑中不同數量的H被D取代，固定的質量數差值分別為4.025Da（含有羧基和胺類的代謝物）和7.044Da（含有羰基和巰基的代謝物）。
4.質譜檢測方法
·使用LC-LTQ-Orbitrap MS進行化合物的檢測，一級質譜的獲得使用全掃描的方式，用Orbitrap作為質量分析器。掃描結束後，將檢測到的原始數據導入Sieve 2.2 軟體進行色譜峰提取，生成一個色譜峰的列表。
·使用Mat lab對這個色譜峰的列表進行數據處理，篩選具有相同保留時間，相似的峰強度且具有特定質量數差異的一對離子作為目標離子。
·對所選出的目標離子進行二級串聯質譜分析，獲得MS2信息。
·選擇具有特徵中性丟失的離子在進行碎裂，獲得目標離子的MS3信息。
作者使用反應試劑分別與四個具有不同官能團的化合物標準品進行分析，用以總結質譜圖特徵以及特定的中性丟失，結果如下：
圖3 | 反應試劑的反應產物
圖ACEG為與未被標記的反應試劑反應的產物；圖BDFH為與被標記的反應試劑反應的產物，圖中綠色箭頭顯示為特徵的中性丟失。在所檢測到的代謝物的二級，如果含有以上的特徵性丟失，那麼產物離子將被進一步進行碎裂產生三級碎裂質譜信息。
研究結論
在碎片離子的獲取過程中，作者首先根據一級質譜中特定的質量數差異對目標離子進行篩選獲取其MS2信息，此外有對具有特徵性中性丟失的碎片離子進一步碎裂獲取MS3信息，由於整個過程中排出了背景離子的幹擾，縮小了目標離子的範圍，使得該方法相比於傳統的數據依賴型掃描對目標離子碎片的獲取有更高的靈敏度。
同時，由於反應試劑中含有比較容易被離子化的叔胺或季胺基團，這些基團的引入也提高了代謝物的離子化效率。作者對四類不同的種標準品的檢測限（信噪比為3）進行分析，結果顯示反應之後的代謝物的檢測限相比於未反應的代謝降低了5-1250倍，靈敏度的提高也更有利於檢測到低豐度到代謝物從而提高整個檢測到覆蓋面。
此外作者還使用標準品建立了一個資料庫，供研究者進行代謝物的鑑定。最後作者將此方法應用於AD小鼠代謝生物標記物的發現中，用以檢測方法的適用性。
小鹿推薦
本文採用同位素標記的反應試劑和未標記發反應試劑分別於代謝物進行反應，提高了檢測靈敏度，拓寬了檢測的覆蓋面，同時反應的特異性也方便研究者對化合物進行鑑定。
部分參考文獻：
(1) Schroeder, B. O.; Backhed, F. Nat Med 2016, 22, 1079-1089.
(2) Rooks, M. G.; Garrett, W . S. Nat Rev Immunol 2016, 16, 341-
352.
(3) Geva-Zatorsky, N.; Sefik, E.; Kua, L.; Pasman, L.; Tan, T. G.; Ortiz-Lopez, A.; Y anortsang, T. B.; Y ang, L.; Jupp, R.; Mathis, D.; Benoist, C.; Kasper, D. L. Cell 2017, 168, 928-943 e911.
......
猜你還想看
◆16s+代謝組學：項目文章 | 恭喜青島農大科學家16s+代謝組學文章喜登Gut
◆16s+代謝組學：項目文章 | 運用16S+代謝組學揭示乳果糖緩解鹽敏感型高血壓的作用機制
◆16s+代謝組學：Hepatology | 運用16S+靶向代謝組學可區分重度飲酒和酒精性肝炎患者
◆16s+代謝組學：16S+代謝組學助力發文醫學一區行業頂刊《Gastroenterology》
◆16s+代謝組學：項目文章EST | 16S+GC-MS代謝組學助力南京大學趙麗娟課題組再登環境科學TOP期刊
END
文章來源於鹿明生物