華南師範大學生命科學學院王璋研究員研究團隊的研究成果刊登ISME，同時，這也是美格基因微生物多組學聯合項目文章！
多組學聯合分析是微生物組研究的秘密武器！本研究利用16S+宏基因組+轉錄組+宏代謝組多組學聯合分析，對慢性阻塞性肺疾病呼吸道微生物群落的功能特徵進行了探究，並揭示了與慢性阻塞性肺疾病發病相關的「菌群-代謝物-宿主靶點」的互作關係，證實了利用公共多組學數據集成分析來研究微生物組-宿主互作關係的可能性。本文第一作者及通訊作者為華南師範大學生命科學學院王璋研究員。
Multi-omic meta-analysis identifies functional signatures of airway microbiome in chronic obstructive pulmonary disease
多組學meta分析揭示慢性阻塞性肺疾病患者呼吸道微生物群落的功能特徵
作者：Zhang Wang1, Yuqiong Yang2, Zhengzheng Yan3, Haiyue Liu3, Boxuan Chen1, Zhenyu Liang2, Fengyan Wang2, Bruce E. Miller4, Ruth Tal-Singer4, Xinzhu Yi1, Jintian Li1, Martin R. Stampfli5, Hongwei Zhou3, Christopher E. Brightling6, James R. Brown7, Martin Wu8, Rongchang Chen2,9 & Wensheng Shu1
期刊：The ISME Journal
時間：2020.07.27
影響因子：9.180
DOI：10.1038/s41396-020-0727-y
一、文章摘要
目前對慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者的呼吸道微生物群落與宿主之間的相互作用知之甚少。本文作者從已公開的COPD微生物組學數據中收集了1640份16S rRNA數據和26份宏基因組數據，採用了多組學meta分析方法鑑定其功能特徵並確定了其微生物屬水平分類單元的變化，隨後使用12個微生物屬建立了COPD全局分類器。
作者結合創新性的數學建模方法，預測出每種代謝物在疾病中的變化趨勢值及其宿主基因靶點，並在1340例慢阻肺公共轉錄組學數據中進行了驗證。結果發現，約30%在慢阻肺中差異表達的宿主免疫信號通路，可被氣道菌群的代謝物靶向作用，且菌群代謝物在疾病中的變化趨勢與其作用宿主靶點的變化趨勢大體一致。
表明在疾病狀態下，氣道菌群與宿主基因表達發生了協同變化最後作者收集了18份COPD患者和10份健康人樣本進行宏基因組、代謝組和轉錄組學檢測，通過獨立人群樣本驗證上述研究推論，發現有69.9%的「菌群-代謝物-宿主基因」的互作通路得到了證實，並篩選出丁酸、高半胱氨酸和棕櫚酸是與COPD宿主靶點相關性最強的微生物代謝產物。是與COPD宿主靶點相關性最強的微生物代謝產物。
二、實驗設計與分析思路
本研究所用於分析的樣本來自分布在亞洲、歐洲和美洲的10個國家（圖1.a），多組學meta分析總體策略如圖1.b所示。
圖1.COPD呼吸道微生物多組學meta分析策略。a：用於meta分析的1640份16S rRNA樣本、26份宏基因組 樣本和1340份宿主轉錄組樣本的地理分布示意圖；b：微生物組學與宿主轉錄組學數據綜合meta分析流程圖，以及多組學數據驗證思路。
三、研究結果
1.COPD患者呼吸道微生物組成分析
針對16S rRNA數據，作者採用DADA2算法進行分析，並使用PICRUSt2進行功能預測分析，發現了2341個EC家族。針對宏基因組數據採用了HUMAnN2進行功能分析並獲得了1236個基因家族信息，其中1124個基因與PICRUSt2預測的結果重合。這1124個基因中有299個是COPD宏基因組數據分析得到的核心基因（在超過90%樣本中存在）。宏基因組分析得到的基因豐度信息與從16S rRNA數據分析推測得到的相應基因豐度存在相關性，表明兩種不同類型組學數據之間的一致性。
對於COPD患者和健康人的16S rRNA數據進行了隨機效應的統計學meta分析，發現共有12個細菌屬顯著差異（圖2.b），與宏基因組數據分析結果基本一致。利用篩選得到1124個基因分析COPD患者和健康人之間的比較分析，通過相關性分析發現其中891個基因在不同的16S rRNA數據之間具有一致的變化趨勢，而這891個基因中的759個基因在宏基因組也表現出一致的趨勢（圖2.d）。
圖2.COPD呼吸道微生物組學數據meta分析。a：與COPD相關的細菌屬熱圖；b：meta分析得出的12個重要細菌屬相對豐度分析；c：ROC分析；d：重要基因的相關性分析。
2.COPD呼吸道微生物代謝潛能預測
利用MetaCyc、STITCH等公共資料庫進行分析，共獲得67種代謝物與244個宿主基因之間的346個代謝組靶向作用關係（圖3.a）。作者針對宏基因組數據採用了PRMT算法根據相關基因的綜合效應情況評估代謝物在疾病狀態下的相對富集率（即PRMT得分），發現棕櫚酸和甘露糖胺的PRMT得分最高，可推測其在COPD患者中可能高度富集（圖3.b）。而棕櫚酸途徑中的8種代謝物中有6種在COPD樣本中顯著升高，而一氧化氮途徑中除硝酸鹽以外的代謝物在COPD樣本中顯著下降（圖3.c）。
通過屬水平物種留一法（Leave-one-genus-out，LOGO）分析確定代謝產物的關鍵微生物驅動因素，估計每個細菌屬對每種代謝物的相對貢獻，共有25個細菌屬被認為是67個代謝產物的顯著貢獻者，其中鏈球菌和嗜血桿菌是大多數代謝物的貢獻者（圖3.d）。對於與COPD密切相關的棕櫚酸，羅斯氏菌屬對其貢獻最大。
圖3.COPD呼吸道微生物群落代謝潛力推測。a：微生物屬、代謝反應、代謝物和宿主靶點之間的相關關係圖；b：PRMT評分排序圖；c：棕櫚酸與一氧化氮生物合成途徑；d：基於LOGO分析的關鍵微生物對代謝物的貢獻熱圖。
3.宿主轉錄組評估代謝物效應
為了評估上述提到的244個宿主靶點是否與COPD特異的宿主免疫反應密切相關，作者在公共資料庫中搜索得到1340份COPD患者與健康對照的呼吸道轉錄組學數據，並進行類似的隨機效應統計學meta分析，發現通過微生物組學預測的菌群代謝物在疾病中的變化趨勢（PRMT得分）與其作用的宿主靶點在轉錄組數據中的綜合變化趨勢呈顯著正相關（圖4.a），如10個與棕櫚酸相關的基因中有8個顯著上調，與在微生物組學分析中棕櫚酸PRMT評分的情況一致，可推測COPD患者的微生物群落與宿主基因表達之間存在某種協同反應。
通過轉錄組meta分析發現有54條宿主代謝途徑的基因顯著富集，其中有16條代謝途徑與上述預測的244個菌群代謝物的宿主靶點重合，並與37種代謝物關聯，表明這些途徑可能受到了微生物代謝產物的調控（圖4.b）。通過進一步分析發現共有19個細菌屬是這37種代謝物的重要貢獻者，其共同構成了296個「微生物-代謝物-宿主」緊密關係鏈。
圖4.微生物組學預測的代謝物靶基因在慢阻肺宿主轉錄組中的變化趨勢。a：代謝產物PRMT評分與其在宿主轉錄組中的疾病促進效應呈正相關；b：與至少一個菌群代謝物互作的差異基因熱圖。
4.多組學驗證宿主與微生物之間的相互作用
為了驗證上述推測的「微生物-代謝物-宿主」之間的相互作用，作者對18名COPD患者和10名健康人進行宏基因組、宏代謝組和轉錄組測序與分析（圖5.a），發現有9個細菌屬、61個微生物基因、33種代謝物和469個宿主基因在差異分析中呈現顯著差異。結合多組學分析結果對上述預測的296個「菌群-代謝物-宿主」緊密關係鏈進行篩選，剔除掉在代謝組數據中無法檢出的氣體代謝物，剩餘272個關係鏈。
對於「代謝物-宿主靶點」的互作，作者通過Spearman相關性分析確認78.1%的代謝物與宿主靶點基因的配對在多組學獨立數據中與預測的結果一致。對於「菌群-代謝物」互作關係，作者通過MIMOSA2軟體進行驗證，85.2%的互作關係得到驗證。
綜上，272個「微生物-代謝物-宿主」關係鏈中有190個（69.9%）在多組學分析中得到了驗證，涉及16個細菌屬、27個代謝物和37個宿主基因。其中91個關係鏈中的代謝物或宿主基因在多組學的差異分析顯著差異（圖5.d）。表明這些關係鏈可能具有慢阻肺的疾病特異性。其中，丁酸與宿主基因SOD2關聯性最強，其次是高半胱氨酸-MMP9和棕櫚酸-ACSL1，而梭桿菌、鏈球菌和羅斯氏菌屬分別是以上代謝物的主要貢獻者（圖5.e）。
圖5.多組學驗證「微生物-代謝物-宿主」關係鏈。a：樣本處理示意圖；b：代謝物實際檢測的代謝物比例；c：31種代謝物PRMT評分與其在慢阻肺代謝組中的變化趨勢的一致性評估。d：91個「微生物-代謝物-宿主」關係鏈驗證結果；e：相關性最強的三對代謝物-宿主靶點基因-細菌屬關係圖。
四、總 結
通過多組學meta分析結合獨立多組學數據驗證，對COPD呼吸道微生物群落的功能特徵進行了探究，並揭示了與COPD發病相關的「菌群-代謝物-宿主靶點」的互作關係。證實了利用公共多組學數據集成分析來研究微生物組-宿主互作關係的可能性。
美格基因現已有宏基因組、宏病毒組、轉錄組、16S等王牌產品，皆可供客戶搭配進行多組學研究，現即將推出代謝組業務，強勢加入多組學研究，多重研究手段助力微生物研究。利用「代謝組+ 」的多組學聯合分析可從原因和結果兩方面分析生物體的內在變化，深入了解微生物的組成、功能及代謝活動，將微生物學的研究推向更高水平，是破譯解釋微生物複雜作用的有效方法。