宏病毒組作為新興檢測手段能夠快速準確的鑑定環境中所有的病毒組成，是一種發現新病毒的有力手段，今天的佳作便是一篇優秀的宏病毒組應用文章。作者通過宏病毒組在淡水中發現多個新的抗生素抗性基因。一起來欣賞這篇2020年8月發表在Microbiome的高分文章。
Freshwater viral metagenome reveals novel and functional phage-borne antibiotic resistance genes
淡水宏病毒組揭示了新的功能性噬菌體抗藥性基因
作者：Kira Moon 等
期刊：Microbiome
時間：2020.08
影響因子： 10.465
DOI：10.1186/s40168-020-00863-4
一、研究背景
細菌產生的抗生素耐藥性對全球健康構成重大威脅。抗生素抗性基因(ARGs)通過多種傳播途徑在不同的細菌種群中傳播，包括噬菌體介導的水平基因轉移。噬菌體攜帶的ARGs被認為具有特別的威脅性，因為它們在環境中持續時間長，複製速度快，能夠感染不同的細菌宿主。幾項使用qPCR和病毒宏基因組學的研究表明，臨床和環境樣本中的病毒片段和病毒序列攜帶許多ARGs。然而，只有在少數由宏基因組序列組裝的病毒群中發現了ARGs，這些基因大多缺乏有效的抗生素耐藥表型。然而，由於病毒宏基因組學的廣泛應用，從不同環境獲得的病毒宏基因組中不斷發現了不同種類的ARGs。因此，噬菌體編碼的ARGs的存在和功能有望被深入討論。
二、實驗結果
1. 病毒組的特性和抗菌素抗性基因
2016年5月，在韓國漢江採集了6個地表水樣本，從10 L樣本中獲得的病毒顆粒，並使用Illumina MiSeq平臺進行元基因組測序，每個位點產生360萬到660萬reads，病毒reads佔12.3%13.8%，其中大部分屬於環境中常見的有尾噬菌體目如肌尾噬菌體科（Myoviridae）, 短尾噬菌體科（Podoviridae）和長尾噬菌體科（Siphoviridae）（圖1），這些噬菌體攜帶多種輔助代謝基因(AMGs)。
圖1 從韓國漢江6個研究點收集的病毒宏基因組reads的分類分布
病毒組reads中ARGs包括內醯胺酶基因、多藥轉運蛋白、多粘菌素耐藥蛋白和萬古黴素耐藥蛋白（表1）。漢江宏病毒組也檢測到內醯胺酶基因和萬古黴素耐藥蛋白，其含量較其他ARGs低。總體來看，漢江病毒群落中ARGs的比例約為0.1%。然而，由於攜帶ARGs的物種的序列長度較短(300 bp)，其分類學尚不明確。病毒組的短片段也不足以預測噬菌體相關的ARGs是通過廣義轉導進入噬菌體衣殼，還是通過特異性轉導進入噬菌體基因組。
表1 預測產生抗生素耐藥性的病毒reads數
2.已組裝的病毒contigs中的抗生素抗性基因
從漢江6個病毒組數據集中，將原始的病毒組reads組裝成contigs。選擇那些至少攜帶一個噬菌體相關基因的contigs，將其視作噬菌體基因組，最終獲得5295個病毒contigs。利用病毒contigs預測的開放閱讀框(ORFs)在ARG-specific database CARD (Comprehensive Antibiotic Resistance)，Resfams，和MEGARes資料庫中搜索，共發現25個ARGs（表2）。
表2 漢江病毒contigs中檢索到的抗生素抗性基因列表
3.由病毒contigs編碼新的功能性β-內醯胺酶
在4個病毒contigs中發現β-內醯胺酶編碼基因（圖2）。其中，H4-C441-ORF28與A類β-內醯胺酶相關，其餘3個ORFs（H1-C74-ORF21，H4-C244-ORF21和H4-C367-ORF18）與metallo-β-內醯胺酶（MBLs）具有相同的核苷酸序列，顯示出同源性。系統發育分析表明（圖3），H4-C441-ORF28屬於A類內酯酶的一個獨特的分支，因此，將這一獨特的A類內酯酶基因命名為blaHRV-1，其產物命名為HRV-1(漢江病毒β-內醯胺酶-1)。三個ORFs（ H1-C74-ORF21、H4-C244-ORF21、H4-C367-ORF18）預測與MBLs相關，將MBLs相關的ORFs歸為B3 MBLs亞類，形成了一個獨立的單系簇，將該新基因及基因產物分別命名為blaHRVM-1和HRVM-1（漢江病毒metallo-β-內醯胺酶-1）。
圖2 4個病毒contigs中發現β-內醯胺酶編碼基因
圖3 系統發育分析
此外，在細菌宏基因組組裝的contigs中搜索HRV-1和HRVM-1的同源序列，發現其中三個宏基因組ORFs中含有HRV-1和HRVM-1，且每一個胺基酸序列相似度都達到100%。同時，這些ORFs的宏基因組群與含有blaHRV-1和blaHRVM-1的病毒群具有高度的同質性，表明漢江細菌群落中存在感染性噬菌體或攜帶blaHRV-1和blaHRVM-1的噬菌體。
三、結論與亮點
1. 在宏病毒組reads和contigs中，我們發現了多種ARGs，包括多粘菌素耐藥基因、多藥外排蛋白和內溶酶基因；
2.當Resfams資料庫中使用較寬鬆的閾值（e值≤1×e5和覆蓋率≥60%）時，檢測到新型的β-內醯胺基因酶blaHRV-1和blaHRVM-1，這些基因具有獨特的序列，分別形成不同的A類和B3亞類的β-內醯胺酶；
3. 在細菌宏基因組中也發現了這些基因，這表明它們是通過積極感染噬菌體而獲得的；
4. 環境中的病毒攜帶了儘管數量很少但尚未報導的功能ARG。因此環境噬菌體可能是變異廣泛、未知的ARGs的宿主，這些ARGs可能通過病毒-宿主相互作用而傳播。
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