Nature綜述：噬菌體的百年研究

【論文題目】 A century of the phage: past, present and future

【期刊名稱】 Nature Reviews Microbiology, 2015,13:777–786

【全文連結】 https://doi.org/10.1038/nrmicro3564

【第一作者】 George P. C. Salmond

【通訊作者】 George P. C. Salmond，Peter C. Fineran

【作者單位】 劍橋大學生物化學系、奧塔哥大學微生物學和免疫學系

亮點

1、基於對噬菌體的研究，人們明確了生物的遺傳物質是DNA，驗證了中心法則，開創了分子生物學新領域，推動了現代生物學的發展；

2、作為地球上豐度最高的生物，噬菌體通過裂解、溶原和水平基因轉移等方式影響宿主的生命周期和進化，發揮重要的生態作用；

3、對噬菌體的研究極大地促進了基因工程和分子生物學的發展，以噬菌體抗菌製劑和CRISPR–Cas系統為代表的基於噬菌體研發出的分子生物學工具正在逐漸影響人們的生活，使人們對生物學產生了顛覆性的認知，同時也產生了巨大的商業價值。

摘要

感染細菌的病毒(即噬菌體)約100年前被發現。從那時起，人們對噬菌體的研究改變了生命科學的基礎認知和相關研究。例如，噬菌體對建立分子生物學中心法則（信息從DNA傳遞至RNA，再傳遞至蛋白質）至關重要，它們在生態系統中扮演著重要角色，並促進細菌進化和產生毒性。此外，對噬菌體的研究為現代生物化學提供了許多技術和試劑：從測序和基因工程到最近發現並利用的CRISPR–Cas噬菌體抗性系統。以時間為線索，我們梳理了一個世紀以來關於噬菌體的研究，並討論了其對基礎生物學和應用生物學的影響。

在1915年和1917年，噬菌體由英國病理學家Frederick Twort和法國–加拿大雙重國籍微生物學家Félix d』Hérelle分別獨立發現(圖1)。Twort描述了微球菌菌落的「玻璃樣轉化」，而d』Hérelle分離出志賀氏桿菌的「抗微生物」，並發明了術語「噬菌體」—即以細菌為食者。

圖1：百年來噬菌體研究中的一些重大事件

EM：電子顯微鏡；ssDNA：單鏈DNA；ssRNA：單鏈RNA。

噬菌體專門針對細菌進行細胞內寄生，並具有多種多樣的生命周期(BOX 1)。d』Hérelle針對噬菌體感染細菌的能力，研究了將其應用於治療細菌感染的潛力。甚至在他的第一篇論文中，他指出痢疾患者痊癒與體內存在噬菌體有關，他還進行了一項使用噬菌體保護兔子免受志賀氏桿菌感染的研究。早期對噬菌體的研究集中在二十世紀20–30年代，重點研究了針對細菌感染開發噬菌體療法，甚至醫藥公司也開始銷售噬菌體製劑。然而，在30年代末期，美國醫學會藥學與化學委員會認為噬菌體療法的療效並不明確，需要進一步深入研究。儘管前蘇聯和其他東歐國家有研究者在進行相關的研究，但這種擔憂和抗菌化學藥品（抗生素）的成功應用導致人們對噬菌體療法的興趣下降。在此期間，人們對噬菌體的基本生物學認識十分有限，直到40年代，噬菌體的本質是病毒這一觀點還存在爭議。40年代初期使用電子顯微鏡觀察噬菌體，才確定其微觀特性。

Box 1：噬菌體生命周期與分類

噬菌體的多樣性非常高，目前主要通過形態學和基因組學對噬菌體進行分類。隨著我們對噬菌體多樣性和基因鑲嵌性的了解越發深入，它們的分類也需要定期更新，這「既是一門科學，也是一門藝術」。最初，d』Hérelle認為噬菌體只能被劃分到「種」水平。隨後，二十世紀40年代電子顯微鏡技術應用使得噬菌體得以基於形態學進行分類。1962年，建立了Lwoff， Horne和Tournier(LHT)分類系統，該系統包含了核酸類型(DNA或RNA)、衣殼形態和包膜性質等方面。1966年成立了國際病毒分類委員會(ICTV)，以提供一個通用的病毒分類方法。2011年，ICTV發布了第九次報告。噬菌體的遺傳物質包括單鏈(ds)或雙鏈(ss)的DNA或RNA，其基因組大小範圍從非常簡單(如MS2噬菌體的ssRNA基因組，約3.5kb)到高度複雜(如芽孢桿菌G噬菌體的dsDNA基因組，約500kb)不等，並且包括可修飾的核苷酸作為對限制酶的保護。形態學上，噬菌體可以是有尾的、多面體的、絲狀的或多形的。有些還具有脂質或脂蛋白包膜。最近，ICTV的原核生物病毒小組委員會對噬菌體和古細菌病毒分類進行了相當系統化的研究。分類系統的詳細信息請登錄ICTV的網站查閱。特徵最明顯的噬菌體屬於有尾噬菌體目(dsDNA基因組，形態學上有尾)，被分為3個科：肌尾病毒科(如T4噬菌體)、長尾病毒科(如λ噬菌體)和短尾病毒科(如T7噬菌體)。

噬菌體可以進行裂解或溶原的生命循環(見圖)。感染宿主細菌時，噬菌體首先作用於宿主細胞的受體，附著後注入其基因組。隨後的複製策略取決於噬菌體是烈性的還是溫和的。烈性噬菌體(如T4噬菌體)只會通過裂解循環進行複製，這一過程包括產生子代噬菌體並將其從被感染細胞中釋放。而溫和噬菌體(如λ噬菌體)可以進入裂解循環或與宿主穩定結合，即溶原態。在溶原過程中，病毒基因組被稱為前噬菌體並與宿主DNA協同複製，或者以游離的、類似質粒的狀態(如P1噬菌體)，抑或整合到宿主的染色體上(如λ噬菌體)。在應激條件下，原噬菌體可以改變溶原狀態，並產生更多的病毒顆粒從細菌中釋放出來。通常子代噬菌體會通過溶解細胞釋放到環境中，導致細菌死亡。而絲狀噬菌體還通過細菌外膜分泌釋放到環境中，這一方式避免了宿主死亡，但會導致慢性感染，使宿主生長速度減緩。

噬菌體的發現使我們對認識更廣闊的生物世界有了巨大的、不可預見的影響。噬菌體「結構簡單」的特性，使得我們可以了解所有生物學相關的核心生物過程。噬菌體提供了簡單有效的模型系統，推動了分子生物學的發展，並提供了包括限制性內切酶在內的諸多有效的生物技術工具。此外，噬菌體對營養鹽循環、致病性和細菌進化的影響突顯出了其在全球生態和進化中的重要作用。而且，抗生素抗性增強，意外推動了通過噬菌體解決細菌感染療法的發展。現在，我們還見證了基於CRISPR–Cas噬菌體防禦系統開發的生物技術的驚人發展，這將徹底改變原核生物和真核生物的分子生物學研究。以時間先後為序，我們強調了自噬菌體被發現後的一百年來對分子生物學起源、對生態和進化的研究，以及對生物技術開發的影響。我們鼓勵讀者想像一下如果噬菌體不存在，現在的世界將是什麼樣子；顯然，我們要感謝這種地球上豐度最高的生命體。

分子生物學的起源

生物學的關鍵問題

在二十世紀早期，基因的本質是生物學的核心問題。包括Leo Szilard, Salvador Luria和Max Delbrück在內的物理學家和其他研究人員開始用噬菌體作為生物模型嘗試解決這個問題以及其他生物學基礎問題。Delbrück鼓勵研究人員使用「經過授權的噬菌體」，即T型噬菌體進行研究，以促進不同實驗室研究結果之間的可比較性。T型噬菌體可以感染大腸桿菌，使其快速成為革蘭氏陰性模式菌。1939年，Emory Ellis和Delbrück在「一步生長實驗」中描述了噬菌體的生長，該研究揭示了噬菌體相關的如吸附、潛伏期和病毒裂解在內的關鍵概念。幾年後，Luria和Delbrück證明突變在選擇過程前就存在，進而印證了達爾文理論的猜測。這種「波動實驗」包括非選擇性的對大腸桿菌進行純培養，然後進行接種，以確定細菌總量和抗T1噬菌體的細菌數量。與突變模型預測一致的是，突變體的數量發生了顯著變化，這是每種培養基中出現突變體的影響因素之一。回顧之前的研究，我們現在可以根據DNA突變來解釋這些實驗，但在當時基因的本質並不為人所知。

通過噬菌體，Alfred Hershey和Martha Chase通過「攪拌實驗」為基因本質上是由DNA組成提供了證據。噬菌體提供了理想的模型系統，因為它由蛋白質外殼和內含的DNA組成，這兩者在當時被懷疑是遺傳物質。他們對噬菌體的蛋白質(³⁵S)和DNA(³²P)使用放射性同位素進行標記。分別用兩種不同同位素標記的T2噬菌體感染未被同位素標記的細胞，之後通過離心去除附著在細胞上的噬菌體顆粒，收集被感染的細胞。該實驗證明DNA與細菌細胞有關，並確定DNA是遺傳物質，因為子代噬菌體中含有³²P，但不含³⁵S。在認可了這項早期關於噬菌體的研究後，Delbrück、Hershey和Luria因發現「病毒的複製機制和基因結構」而在1969年獲得了諾貝爾生理學或醫學獎。在Hershey和Chase之後，Seymour Benzer通過研究T4噬菌體的rII區域分析出基因的準確結構。他通過將多個T4噬菌體rII突變體共同感染大腸桿菌來計算重組頻率，從而生成rII區的高解析度遺傳圖譜。Francis Crick後來也使用該系統驗證支持遺傳密碼的三聯體性質。

二十世紀50–60年代，當分子生物學提出中心法則時，人們還不知道基因如何被調節。François Jacob和Jacques Monod發現了「酶誘導」現象，該現象表明酶只有在底物存在的時候才會活化。通過大腸桿菌的lac系統，他們發現基因的轉錄是通過共同的阻遏蛋白調控的。儘管這些研究開發了一些噬菌體系統，但Jacob也在研究與其原理相似的λ前噬菌體誘導現象。對λ噬菌體遺傳迴路的進一步研究為基因調控提供了許多範例，包括鑑定DNA結合阻遏物和激活蛋白，以及轉錄抗終止劑。Jacob、Monod和André Lwoff因「在研究酶和病毒合成的基因調控方面的貢獻」而獲得1965年的諾貝爾生理學或和醫學獎。這些開創性的研究，通過將分析能力與簡潔明了的活體實驗相結合，定義並開啟了現代的「基因工程」。

分子生物學的「誕生」

早期的研究中隨著對噬菌體分子生物的深入認識，發現了一些分子生物試劑，這是令人意想不到的收穫。二十世紀50年代初期發現了限制–修飾(R–M)現象，這是噬菌體通過特定種類的大腸桿菌獲得的非遺傳變異。然而，在60年代末和70年代初，R–M系統被發現可以通過修飾(通常是通過甲基化)來保護它不被限制性內切酶切割。限制性內切酶(II型)的序列特異性促進了切割離散DNA片段技術的發展，並且T4噬菌體DNA連接酶可用於將分子連接在一起。使用這些新的基因克隆試劑，是分子生物學和生物技術行業的重大發展。Werner Arber、Daniel Nathans和Hamilton Smith因「發現了限制性內切酶並將其應用於分子遺傳學」而獲得1978年的諾貝爾生理學或醫學獎。為了操縱和擴增DNA片段，需要克隆載體。除質粒外，噬菌體還提供了重要的克隆解決方案。λ噬菌體被開發為有效的克隆載體，對λ噬菌體的研究使粘性質粒得以發展，從而可以克隆大的DNA片段，在體外包裝成噬菌體顆粒並有效地傳遞到大腸桿菌中。通過研究P1噬菌體衍生出的人工染色體可以用於克隆大的DNA片段。此外，通過研究基於M13噬菌體的載體，T7噬菌體DNA聚合酶提供了高質量的DNA測序解決方案。

這些進展為分離和研究基因提供了必要的工具。噬菌體技術還可以誘變細菌的基因進行功能研究。例如在隨機誘變研究中，通過λ噬菌體自殺載體(進入宿主後無法複製)來運輸轉座子。此外，定點誘變系統來自M13和fd噬菌體。另一個例子是一種溫和噬菌體—Mu噬菌體(突變體)，可隨機轉入大腸桿菌基因組並產生突變體。這些特點已應用到各種細菌，以產生隨機突變體，並與報告基因結合，將轉錄和翻譯融合一體用於檢測基因表達。

許多噬菌體衍生工具被應用於DNA測序，但噬菌體基因組同樣是最早被測序的。例如，1976年Walter Fiers的研究組對MS2噬菌體基因組進行了測序，這是最早被測序的單鏈RNA(ssRNA)噬菌體基因組。1977年，Fred Sanger和他的研究組對ΦX174噬菌體的基因組進行了測序，這是最早被測序的單鏈DNA(ssDNA)噬菌體基因組。1982年，對λ噬菌體的基因組進行了測序，這是最早被測序的雙鏈DNA(dsDNA)噬菌體基因組。通過使用限制酶、T4 DNA連接酶和M13載體對λ噬菌體進行鳥槍法測序——這幾乎全都是噬菌體的衍生物。這些方法後來被應用於從大腸桿菌到人類的諸多全基因組項目。因而，不可否認的是，噬菌體對生物學的發展影響是極其深遠的。

生態和進化

多樣性、豐度和生態系統

噬菌體基礎研究和轉化研究的成功產生了巨大的影響。由於受到噬菌體衍生出的分子生物學新「工具包」的影響，許多研究人員開始關注除大腸桿菌以外的細菌和更複雜的真核生物，這些生物在遺傳上易於處理。然而，從二十世紀80年代到二十一世紀的研究也重新喚醒了我們對基礎噬菌體生物學的理解。人們一直認為水環境中的噬菌體數量很少，直到在1989年檢測到每毫升天然水體中病毒高達2.5×10⁸(典型範圍約10⁶—10⁷)，這表明噬菌體在微生物轉化和環境中基因轉移方面起著重要作用。病毒顯然在食物網和海洋的碳氮循環過程中十分活躍。此外，一些海洋噬菌體的基因組含有輔助代謝基因(如編碼光合蛋白的基因)，這些基因被認為可以通過「補充」限制宿主代謝的功能來輔助噬菌體感染。對海洋樣品的宏基因組研究，展示了噬菌體豐度和多樣性的真實情況。幾乎所有環境中，包括動植物相關的對噬菌體豐度和多樣性的認識已經被廣泛接受了。

測序技術的改進導致噬菌體基因組數據激增，進一步揭示了進化相關性和基因組鑲嵌關係，對噬菌體的分類也有著重要意義。然而，儘管有著海量的噬菌體基因組數據(特別是新一代測序方法出現後)，噬菌體通常編碼的病毒蛋白並沒有已知的同源物，並且推測這些「未知」定義了新的生物學過程。因此，我們對噬菌體及其生命周期的認識仍存在巨大空白(BOX 1)。

為了深入了解噬菌體的生態和進化作用，必須考慮它們與宿主細菌的共同進化。d』Hérelle在1917年觀察到痢疾患者在康復前的糞便樣本中病毒數量明顯增加，這可能是對噬菌體與細菌之間相互作用的動態的早期生態學認識。在自然環境和實驗室環境中的共同進化實驗表明，共同進化可以促進噬菌體和細菌進化的速度，維持遺傳和表型變異，並可改變微生物群落結構。的確，噬菌體和細菌構成了地球上最大的生物多樣性並不為奇。在實驗室中控制大型細菌和噬菌體種群的便捷性和速度，有利於將其應用於解決進化論中更普遍的問題——一種稱為實驗進化的方法。新一代測序技術可以闡明表型和種群轉變的遺傳變化，將進一步提高噬菌體-細菌系統作為生態和實驗進化模型的效用。最後，CRISPR-Cas系統將宿主細菌與噬菌體聯繫起來的能力，無疑將促進我們對複雜生態系統中以及進化背景下它們相互作用的理解(BOX 2)。

Box 2：CRISPR–Cas適應性免疫系統

CRISPR–Cas系統為細菌和古菌提供了針對外來入侵(如質粒和噬菌體)的適應性免疫系統。然而，他們也可以參與不同的細胞過程。

CRISPR序列由來自感染者的移動遺傳組件(MGEs)的間隔序列分隔的短重複序列組成，提供了「適應性免疫」。Cas蛋白提供了抵抗入侵核酸的機制。CRISPR–Cas系統被分為兩類，五個主要類型 (I–V型)和許多亞型。三種類型(I-III型)和最近的V型已經被從機理方面描述，儘管總體功能原理保守，但它們顯示出顯著的差異。

CRISPR–Cas系統分三個步驟工作，即適應(或獲取)、表達和幹擾(見圖)。適應包括內切酶Cas1和Cas2，它們獲得新的間隔區並將其添加到CRISPR中，並伴隨著重複複製。表達階段，cas基因和CRISPR被轉錄。

CRISPR全長轉錄本被稱為前CRISPR RNA(前crRNA)，並被加工成包含MGE衍生間隔序列和重複序列部分的CRIAPR RNA(crRNA)。不同系統中的crRNA是不同的。在1類(I型和III型)系統中，crRNA產生通常涉及Cas6核糖核酸內切酶。2類(II型和V型)系統中需要Cas9，宿主RNase III和非編碼RNA(用於激活crRNA(tracrRNA))進行pre-crRNA處理；而在V型系統中，Cpf1會獨立於tracrRNA生成crRNA。在1類系統中，crRNA形成Cas-核糖核蛋白複合物的一部分；而在2類系統中，單個蛋白質(Cas9或Cpf1)與crRNA形成複合物，Cas9也與tracrRNA形成複合物。幹擾期間，這些複合物識別並降解MGE。在I型系統中，對互補DNA(原間隔區)的識別會導致Cas3的補充，從而降解入侵DNA。III型系統以轉錄依賴性方式靶向RNA和DNA。最後，II型和V型幹擾分別導致Cas9–tracrRNA–crRNA或Cpf1–crRNA複合物降解DNA。

除了CRISPR-Cas的應用外，這些系統的生物學特性同樣令人印象深刻，並揭示了噬菌體與細菌相互作用的新維度特徵。例如，在被MGE「免疫」時，一些CRISPR-Cas系統優先從入侵者那裡以複製依賴的方式獲得新的間隔區。這限制了「自身免疫」的問題，並對攻擊性複製MGE的反應增強。III型系統有另一個針對裂解噬菌體繁殖的技巧，而不是細菌基因組中的前噬菌體。然而，噬菌體可以通過點突變來破壞識別過程中的互補性，從而躲避CRISPR–Cas系統。令人驚奇的是，在被稱為「激發」的過程中CRISPR–Cas系統甚至可以檢測到嚴重變異的入侵者，並迅速獲得間隔區以產生新的免疫。相對應的，一些噬菌體通過表達抑制抗性機制的抗CRISPR蛋白來應對CRISPR-Cas免疫。更複雜的是，霍亂弧菌噬菌體編碼一種CRISPR-Cas系統，必須在含有抗噬菌體誘導的染色體島(PICI)的菌株中進行複製。顯然，關於CRISPR-Cas系統以及它們與噬菌體和其他MGE的進化關係，還有很多需要研究的地方。PAM，前間區序列鄰近基序。

細菌的致病性與進化

根據估算，全球每秒鐘大約發生2×10¹⁶次噬菌體介導的基因轉移事件，這可以體現出噬菌體對細菌進化的影響(圖2)。此外，在1996年發現了霍亂弧菌毒素(一種關鍵毒力因子)被編碼在可轉移絲狀噬菌體CTXΦ的基因組中，這一發現突出了噬菌體在細菌致病性進化中的重要性。此過程被稱為溶原性轉化(或噬菌體轉化)，最早於二十世紀50年代觀察到，它描述了前噬菌體提供有利於溶原的額外基因的情況(圖2)。二十世紀90年代進一步驗證了噬菌體對細菌致病性的重要性，當時基因組測序揭示了大量的噬菌體，並確定它們可以解釋密切相關的細菌菌株之間產生主要遺傳變異性(例如，病原體與非病原體)。例如，在化膿性鏈球菌中，約10％的基因組由編碼多種毒力因子的噬菌體組成，而在大腸桿菌O157:H7 str. Sakai中，18種前噬菌體構成其基因組的16％。一些情況下，噬菌體為細菌提供了致病性的核心機制。例如，在產毒大腸桿菌中，噬菌體誘導上調了毒素基因，而細胞裂解對於毒素釋放很重要。最後，顯示同源區域的前噬菌體可以通過倒位、缺失和與其他染色體重組來驅動進化(圖2)。例如，在日本分離到的化膿性鏈球菌M3菌株與在美國分離的菌株不同，這是因為兩種不同的前噬菌體之間發生了染色體倒位，導致前噬菌體毒力基因發生重組。倒位和缺失還可以通過驅動快速進化的選擇事件來調控適合度。

圖2：噬菌體在細菌致病性和進化中的作用

噬菌體通過多種機制影響細菌的致病性和進化，包括通過水平基因轉移(HGT)產生遺傳多樣性。

a 噬菌體介導的細胞裂解可以釋放轉化獲得的裸露DNA；

b 噬菌體可以通過廣義轉導，將宿主或質粒DNA的隨機片段直接注入鄰近的細菌中；

c 溫和噬菌體可以通過特殊的轉導途徑移動宿主的側翼基因；

d 噬菌體誘導染色體島(PICIs)可以劫持「輔助」噬菌體，實現島的高效轉導；

e 基因轉移劑(GTAs)是細菌染色體上的非複製性噬菌體樣單元，它包裹並轉導宿主DNA，進行組成性轉導；

f 在溶原過程中，溫和噬菌體可以通過攜帶編碼不同蛋白質(如細菌分泌或裂解時釋放的毒素)的基因進入溶原態；

g 前噬菌體還可以通過倒位或缺失來促進重組事件，從而導致前噬菌體和基因組重排；

h 與噬菌體有關的元素(如R型腐毒素和VI型分泌系統(T6SSs)，它們在結構上都與噬菌體尾部相似)，是細菌武器庫的一部分。

噬菌體還會影響細菌之間的水平基因轉移(HGT)。例如，通過誘導細菌裂解，噬菌體促進細菌DNA釋放，然後可被鄰近的感受態細胞獲取(圖2)。此外，噬菌體通過基因轉導衍生大量HGT，在這種情況下，細菌DNA在噬菌體複製過程中被意外獲取，然後傳遞到鄰近細胞中(圖2)。這一現象在1952年由Norton Zinder和Joshua Lederberg發現，Joshua Lederberg因「發現關於遺傳重組和細菌遺傳物質組織」而獲得1958年諾貝爾生理學或醫學獎。特異性轉導是指不精確切除後置於完整前噬菌體附近的DNA的轉移(圖2)。轉導有助於抗生素抗性和毒力基因的轉移，而抗生素暴露可促進這些過程。基因轉移劑(GTAs)促進了一種「組成型廣義轉導」，其在細菌HGT中具有重要作用。GTAs是細菌基因組中編碼的類似於前噬菌體的部分，可隨機包裝宿主DNA，但包裝不足以實現其自身基因的傳遞(圖2)。GTAs可能是由突變的前噬菌體進化而來，前噬菌體變得有缺陷，隨後衰退。噬菌體誘導性染色體島(PICIs)可以劫持噬菌體以協助其轉移，從而產生高效轉導，將這些島轉移至鄰近細菌(圖2)。例如，金黃色葡萄球菌致病島(SaPIs)編碼超抗原並「寄生」噬菌體以進行高頻轉導。由於人們對於精確識別PICIs和GTAs具有挑戰性，因此它們對基因轉移的貢獻可能被低估了。

除了向細菌提供毒力基因外，噬菌體本身可能已在細菌R型膿菌素和VI型分泌系統的進化過程中被選擇(圖2)。VI型分泌系統使用噬菌體尾狀細胞穿刺機制將效應蛋白遞送到真核和原核細胞中。R型膿菌素類是細菌基因組中編碼的近似噬菌體尾狀結構，在細胞裂解過程中釋放、結合併殺死其他細菌。值得注意的是，一些海洋細菌釋放出一系列尾狀結構，這些結構可以誘導海洋結核蟲變態，這表明細菌可以利用噬菌體狀結構與真核生物相互作用。總而言之，這些研究證明噬菌體可通過多種方式促進細菌的毒力和宿主之間的相互作用。

生物技術開發

噬菌體作為代用抗菌劑

最近，細菌的抗生素耐藥性增強以及新型抗生素的匱乏促使農業、醫藥和某些食品行業重新流行起噬菌體抗菌的方法(圖3)。利用噬菌體對細菌進行敏感和特異性檢測也引人關注。人們正在開發多種檢測方法，包括基於噬菌體誘導的裂解、噬菌體擴增、報告基因傳遞、細胞表面結合蛋白和生物傳感器的系統。使用天然或改良噬菌體的噬菌體療法顯示出令人鼓舞的治療效果，並且正在進行受控的臨床試驗。例如，用於治療銅綠假單胞菌耳部感染的噬菌體混合物顯示出明顯的功效和安全性。目前，一項涉及三個歐洲國家的I/II期臨床試驗，正在研究噬菌體用於治療感染大腸桿菌和銅綠假單胞菌的燒傷創面的安全性和有效性(稱為PhagoBurn臨床試驗)。在食品安全和農業方面，噬菌體技術的應用速度越來越快，有幾種批准的產品已經上市。例如用於保護加工食品免受李斯特菌侵害的LISTEX P100(荷蘭Micreos)和ListShield(Intralytix；美國馬裡蘭州巴爾的摩)。

圖3：一些基於噬菌體的抗菌方法

噬菌體及其產物提供了一種新的抗菌策略。

a 噬菌體的特異性可用於噬菌體治療，通過噬菌體靶向攻擊特定的細菌病原體；

b 噬菌體的產物(例如酶)可用於針對特定的細菌，包括病原體；

c 噬菌體可以通過靶向嵌入細菌中的某些結構來破壞生物膜，並且可以被設計用來釋放降解生物被膜基質的特定酶；

d 噬菌體可用于敏化抗生素抗性細菌。例如，噬菌體可以將抗生素敏感基因導入耐藥宿主，這種策略可以與抗生素治療相結合。

越來越多的使用噬菌體產品或工程噬菌體的新抗菌方法正在開發中(圖3)。大量研究集中在內溶素上，內溶素是在噬菌體複製過程中參與細胞裂解的肽聚糖水解酶。在革蘭氏陰性細菌中，外膜還必須通過複合物(稱為斯潘金斯(spanins))破壞，並融合兩個膜。內溶素通常由酶活性結構域和細胞壁結合結構域組成。內溶素種類多樣，大多數內溶素具有物種特異性，有些則可感染多個物種。內溶素的模塊化促進了不同域的「混合和匹配」，以增加活性並改變宿主範圍。通過將內溶素融合到其他結構域，可以將內溶素穿過革蘭氏陰性外膜或傳遞到真核細胞中以靶向細胞內細菌。目前正在進行局部和靜脈內使用內溶素控制人類金黃色葡萄球菌感染的I期和II期臨床試驗，並且已經在各種感染模型中進行了臨床前試驗。第一種上市的內溶素Staphefekt可用於治療由金黃色葡萄球菌引起的人類皮膚感染。

使用內溶素的一種補充方法涉及利用尾釘或可擴散的多糖解聚酶，這可以降低如胞外多糖(EPSs)和脂多糖(LPSs)等表面聚合物的水平。去除多糖可以破壞生物膜，降低毒力並通過宿主免疫系統協助清除細菌。在此前提下，T7噬菌體被設計為在大腸桿菌生物膜感染期間表達EPS降解酶。細胞裂解釋放出EPS降解酶，有助於噬菌體感染並增強抗生物膜和抗菌作用(圖3)。噬菌體對其靶細菌的特異性通常被認為具有治療優勢，因為這可以限制對有益微生物的附帶損害。對於可降解EPS的T7噬菌體，可通過從T3噬菌體引入基因1.2來擴展其宿主範圍，從而增強其實用性，能夠感染含有F質粒的大腸桿菌。還可以利用進化來選擇改變的受體識別和宿主範圍。例如，λ噬菌體的體外進化可以識別新孔蛋白受體外膜蛋白F(OmpF)。在自然環境中，博德特氏菌噬菌體BPP-1通過產生多樣性、位點特異性、易錯的逆轉錄來加速其尾部纖維進化，從而改變其宿主範圍。噬菌體的特異性及其DNA傳遞效率已被用於注射致命基因的細菌，這些基因編碼內切酶、膽鹼、毒素-抗毒素系統的毒素或濃縮DNA的蛋白質(例如SASPject; Phico Therapeutics, Cambridge, UK)。

噬菌體還可以提高抗生素功效(圖3)。例如，抗生素可以偶聯到噬菌體上，使其能夠傳遞到特定的細菌細胞，並導致局部藥物濃度的增加。此外，通過使用噬菌體注射突變基因(例如rpsL和gyrA)的致敏等位基因來恢復藥物功效，可以克服抗生素耐藥性。另外，調控基因的傳遞可以以一種特定的方式重新編程細胞。例如，引入抑制應激反應的基因(例如exA)，改善藥物吸收(例如ompF)或抑制生物膜產生(例如csrA)，都可以增加大腸桿菌的抗生素敏感性。因此，噬菌體提供了廣泛的潛在方法來解決細菌感染和抗生素耐藥性。但是，噬菌體工程依然面臨一些需要解決的法律問題。

合成生物學與納米技術

絲狀噬菌體是對生物技術和納米技術產生重大影響的一類噬菌體。這些噬菌體(例如M13和fd)具有小的插入物ssDNA基因組，不經分裂能夠從細菌中分泌出來。George Smith首創了這一噬菌體展示技術。這種商業化的技術利用了基因型和表型之間的物理聯繫，並基於對大量噬菌體的篩選。不同DNA序列文庫被整合到一個外殼蛋白基因上，相應的編碼蛋白在病毒組裝後顯示在病毒顆粒表面。通常，噬菌體展示選擇與特定靶點結合的蛋白質；與靶點結合的噬菌體被分離並重新增殖，而不與靶點結合的噬菌體則被衝走。噬菌體展示的方式是多種多樣的。例如，納米醫學的新興領域涉及將納米結構用於治療性藥物的靶向傳遞或分子檢測或診斷。通過使用噬菌體展示技術，可以將肽或整個噬菌體設計成藥物、疫苗或成像標記到特定位置，或者靶向識別癌細胞或細菌感染。類似的方法正在被應用於具有對材料科學有用特性的工程噬菌體。例如，已經由絲狀噬菌體構建高功率的鋰離子電池，並且可以組裝液晶納米結構。

除了被工程化為有用的納米結構外，天然噬菌體也是複雜的分子自組裝納米機器。自從首次在電子顯微鏡下觀察噬菌體以來，許多研究小組已將X射線晶體學和電子顯微鏡相結合來確定高解析度病毒結構。可視化的大多數噬菌體(約96％)是有尾巴的，屬於有尾噬菌體目，分為三個科(肌尾病毒科、長尾病毒科、短尾病毒科)。肌病毒科具有直的可收縮尾巴，長尾病毒科具有柔性的非收縮尾巴，而短尾病毒科具有短的尾巴。有尾噬菌體目的結構蛋白具有相似的摺疊方式，表明它們具有共同的進化歷史，但是也存在相當大的形態變異。多數噬菌體衣殼為二十面體，但有些為扁長(即拉長)。有尾噬菌體目的主要衣殼蛋白具有高度保守的HK97摺疊，並需要腳手架蛋白來建立合適的衣殼幾何形狀。空衣殼(即前衣殼)被降解支架蛋白的蛋白酶成熟，然後以能量依賴的方式通過包裝複合體轉運DNA，從而緊密包裝線性dsDNA基因組。包裝涉及大小不同的末端——一些最強大和最快的分子機器——切割基因組長度的DNA單元，並將其驅動到衣殼中。然後加入多個蛋白質堵住入口，準備頭部與噬菌體尾部結合。與短尾噬菌體科(尾巴直接在門戶頂點上組裝)相反，肌尾噬菌體科和長尾噬菌體科獨立地合成尾巴，然後將它們連接到衣殼上以完成組裝。尾巴結構參與特異性受體的識別，穿透細胞膜並將病毒基因組向宿主細胞的傳遞。近年來，冷凍電子顯微鏡揭示了病毒「尋找」受體的顯著方面(在噬菌體T7中發生在「隨機遊動」中)，並揭示了DNA注射、細胞內衣殼成熟、DNA緊密包裝和裂解過程中的結構重構。

噬菌體也影響了合成生物學的發展。合成生物學旨在建立具有可預測特性的「從頭開始」的合成系統，噬菌體提供了新穎的分子部分和易處理的模型系統。ΦX174噬菌體是第一個完全人工合成的噬菌體基因組。噬菌體整合和重組酶催化兩個序列(att位點)的位點特異性重組，其中許多包括來自噬菌體Bxb1和噬菌體ΦC31的序列，已在合成生物學和其他應用中用於驅動整合、切除和倒位過程。這些酶可以控制溫和噬菌體整合進細菌基因組和從細菌基因組中切除(BOX 1)。另一個廣泛使用的系統是噬菌體P1的Cre–loxP位點特異性重組系統，該系統可以以受控方式在真核生物或細菌中產生明確的遺傳改變。當重組酶的表達與輸入信號相連時，它們可以引起DNA序列的改變，從而生成迴路，並提供可重寫的遺傳記憶。此外，T7 RNA聚合酶可用於設計合成迴路。通過將T7 RNA聚合酶分為兩個部分，這些部分可以由不同的輸入獨立控制，只有當兩個信號都存在時，可以進行工程設計的AND邏輯門才能生成輸出。因此，使用電池中的噬菌體作為記憶體進行生物計算可能不僅僅停留在科幻小說領域。

CRISPR–Cas抗性革命

在與噬菌體共同演化過程中，細菌獲得了許多抗病毒策略，並且仍在演化出新的類型。這些抗性系統的基礎研究產生了偶然的發現，這些發現使得強大的創新和轉化應用成為可能。R–M系統是這些意想不到和無法預測的回饋的經典案例。另一種具有顯著商業效益的抗藥性類別是抗感染系統，通過噬菌體感染細菌的「利他細胞自殺」給予群體水平的保護。最近，CRISPR-Cas適應性免疫系統(BOX 2)的發現和表徵再次證明，基本的噬菌體研究通常會產生具有廣泛生物技術實用性的複雜工具。2007年首次報導了CRISPR–Cas可以提供針對噬菌體的免疫能力，僅在5年後就有可能利用這些系統進行基因組編輯。

自2012年以來，基於CRISPR–Cas系統的應用數量激增。這些研究進展集中在II型CRISPR-Cas系統(BOX 2)上，這是因為一種蛋白質(Cas9)和一種工程化單元引導RNA(sgRNA)能夠引導互補DNA序列中的斷裂雙鏈。通過非同源末端連接或同源性定向修復，可以在多種生物體中產生自發或特異性突變，包括噬菌體、細菌、真菌、植物和動物。此外，一個有核缺陷的Cas9產生一個RNA引導的蛋白質，結合到特定的DNA區域來抑制基因表達，或者與激活結構融合時增強轉錄。進一步的發展包括建立大型的sgRNA文庫，該文庫可對基因功能進行全基因組篩選，以幫助藥物靶標鑑定。

CRISPR–Cas9適用於模式生物和非模式生物，從而推動了基因功能的廣泛研究，以及農業部門和多種生物醫學應用中改良農作物和動物的發展。例如，將細胞改造為靶向HIV的藥物，這會破壞潛在的病毒基因組並保護細胞免受新的病毒感染。使用CRISPR–Cas9來改變生態系統，以控制害蟲物種或消滅疾病媒介，如蚊子也是當下研究熱點。實際上，在實驗室實驗中，CRISPR–Cas9基因驅動器能夠通過果蠅快速傳播突變等位基因。在細菌中，CRISPR–Cas系統也可用於在多個細菌基因組中產生突變，並有可能用於合成生物學和代謝途徑工程，已被視為一種新型的抗菌策略。例如，CRISPR-Cas系統可以特定序列的方式殺死細菌，選擇性地消除特定菌株，選擇因致病性島丟失而毒性較低的倖存者，並通過靶向耐藥基因來抑制抗生素耐藥細菌。此外，CRISPR-Cas9可以用來操縱噬菌體基因組，從而更容易地和精確地研究噬菌體生物學。儘管前景看好，但這些發展也引發了許多倫理和監管問題。

結論和展望

噬菌體研究在一個世紀以來對生物學的影響是十分驚人的，其商業影響是無法估量的。如果沒有噬菌體研究(例如，限制性內切酶、噬菌體展示和現在的CRISPR-Cas系統)，全球生物技術業務將可能寥寥無幾，一系列基於噬菌體的重要技術和潛在療法將不復存在。除了噬菌體在幫助確定核心生物學原理方面的歷史作用外，認可它們超高的教育價值也很重要。Graham Hatfull等人領導的傑出的「公眾科學」(霍華德·休斯醫學研究所(HHMI)—科學教育聯盟(SEA)—噬菌體研究促進基因組學和進化科學(PHAGES))就是一個很好的例子。通過實用的噬菌體工作，向成千上萬的大學生和高中生介紹了生物學和進化的核心原理，更重要的是，科學研究具有令人興奮和變幻莫測的性質。這為感染單個細菌株的噬菌體產生了最大數量(>800)的基因組序列，表明我們對大約70%噬菌體基因產物功能的認識還是空白。

最近的研究還發現了「巨型」噬菌體，其基因組大於某些細菌的基因組。因此，至少在大小上，細菌和病毒之間的基因組分界可能會逐漸融合成一個遺傳連續體，從而引發了關於地球生命進化本質的有趣問題。這突出了一個重要的事實，這將使噬菌體研究的新世紀變得異常激動人心。考慮到全球範圍內噬菌體的絕對豐度以及我們對其大部分基因功能的完全無知，在噬菌體的基礎研究中，一定還有許多未知需要我們去發掘。噬菌體感染的轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學分析的新技術將揭示噬菌體新的功能和調控的複雜性。根據過去100年來的經驗，這些未來的一些發現無疑將被有力地轉化為醫學、農業和工業生物技術。

當然，在未來幾年裡，我們還可以期待更多，尤其是基於噬菌體的工具的開發，這些工具可以重新用於不同的合成生物學領域。專注於一個單一的當代噬菌體研究「產品」，應該足以讓我們相信令人興奮和有影響力的未來可能性。基於CRISPR-Cas系統的技術已經使真核生物研究發生了革命性的變化，並產生了附帶的倫理問題，因為它能夠高保真地操縱基因組——最終可能是為了有針對性地重新設計(編輯)我們自己的基因組。人類發現了噬菌體，僅僅一個世紀，通過噬菌體就發掘了一些生物學和生物化學的秘密，取得了令人難以置信的結果。因此，也許噬菌體研究的最終生物技術可能是人類從醫學治療到進化等方面對自身基因的操控。

未來100年將揭示什麼？如果一個世紀前Twort和d』Hérelle被問到過這個問題，那麼他們不可能想像到我們今天所知道的一切。所以，對我們來說，噬菌體的全部潛力必然是不可預測的。重要的是，噬菌體生物學產生最大影響的應用技術(如限制性酶和CRISPR-Cas)源於好奇心驅動的對噬菌體基本現象的研究。對於基礎生物科學的投入，沒有比這更好的理由了。最後需要強調的是，創新發明不能僅通過優先資助低風險的戰略研究的政策來產生。因此，假設繼續對噬菌體基礎研究進行投資，我們預計將進入令人興奮的第二個世紀。當然，噬菌體生物學第一個世紀的研究所產生的巨大影響一定會使所有人相信這一點。

THE

END

翻譯：續子傑

校對：肖鵬、譚鳳嬌

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