Nature |人類STING起源於古老細菌的噬菌體防禦機制

撰文 | Qi

責編 | 兮

幹擾素基因刺激蛋白（Stimulator of interferon genes, STING）是人類細胞中的一種可感知細菌感染過程中釋放的外來環二核苷酸，以及病毒感染和抗腫瘤免疫過程中的內源性環狀GMP-AMP（cGAMP）信號傳導的受體【1】。截至目前，已有諸多研究證實cGAS（cyclic GMP–AMP synthase）-STING通路作為動物的細胞自主性固有免疫系統的核心成分。

越來越多的證據表明，真核生物固有免疫系統的重要組成部分在細菌免疫系統中均具有對應的部分。例如，Argonaute已被證明是植物，昆蟲和動物的抗病毒RNA幹擾機制中的核心蛋白，也有報導指出它在細菌和古細菌中同樣具有免疫作用【2-4】。2019年發表在Nature雜誌上的一項研究【5】發現原核生物中cGAS信號傳導具有與真核生物相似的抗病毒作用（Nature深度|細菌中也有cGAS？哈佛科學家發現發現一大類cGAS/DncV樣核苷酸轉移酶）。這些結果引出一種假設，即這些在原核生物中首先進化為抵抗噬菌體的防禦手段，被古代的真核生物所繼承，並奠定真核生物原始免疫系統的基礎。然而，由於STING蛋白與其他已知的信號蛋白沒有結構同源性，其功能分析受到限制，且無法解釋哺乳動物固有免疫中環狀二核苷酸信號的起源【6-9】。

2020年9月2日，來自美國哈佛醫學院的Philip J. Kranzusch課題組在Nature上發表了題為「STING cyclic dinucleotide sensing originated in bacteria」的文章，該研究通過對細菌STING蛋白晶體結構的分析，解釋了STING依賴性信號傳導的機制，並揭示原核生物抗噬菌體防禦中功能性cGAS-STING通路的保守性【10】。

研究人員通過對原核生物噬菌體防禦島的生信分析，得出一組具有STING同源性候選蛋白的差異性基因。為了解STING在細菌信號傳導中的潛在作用，研究人員首先確定黃桿菌科（Flavobacteriaceae sp.）和顆粒二氧化碳噬纖維菌（Capnocytophaga granulosa）中候選STING同源物的1.8Å和2.8Å晶體結構。通過確定與3&39;-cGAMP形成複合物的黃桿菌科STING（FsSTING）結構，證實細菌STINGs是功能性環狀二核苷酸受體，且具有典型的類似於人STING蛋白中觀察到的「V形同型二聚體」和「疏水性α-helix」的結構。儘管整體結構與人STING保持一致，但細菌STING蛋白體積卻相對小20％，且結構更為緊湊。此外，差異還表現為β鏈蓋結構域內的延伸，誘導自噬所需的末端α-螺旋的添加以及脊椎動物中激酶和轉錄因子募集所需的無結構的C末端尾巴（見下圖1）。

圖1，細菌STING與人類STING的結構分析

隨後，研究人員分析細菌STING序列發現，84％在環狀寡核苷酸的信號系統（Cyclic Oligonucleotide-Based Signalling System, CBASS）操縱子中編碼。類似於cGAS依賴的人類細胞中對病毒複製的感知，CBASS免疫依賴於CD-NTase（cGAS/DncV-like nucleotidyltransferases）的激活來引發第二信使依賴性抗病毒效應子應答。研究人員克隆了黃桿菌科的CD-NTase CdnE，並觀察到FsCdnE特異性合成用於調節細菌生長和細胞內信號傳導的常見核苷酸第二信使，環狀二鳥苷酸（c-di-GMP）。隨之，分析所有包含STING的CBASS操縱子的基因組背景，發現細菌中含有STING的CBASS操縱子主要存在於擬桿菌（Bacteroides）中，進一步確認幾乎完全在缺乏經典GGDEF（Gly-Gly-Asp-Glu-Phe）和EAL（Glu-Ala-Leu）c-di-GMP信號域的細菌中編碼。

接下來，研究人員通過突變分析，驗證STING環狀二核苷酸結合口袋中殘基的重要性，並確認了c-di-GMP識別需要保守的核鹼基接觸。人STING不會與環狀二核苷酸形成明顯的序列特異性接觸。取而代之的是，人STING殘基R232與磷酸二酯骨架存在額外接觸，且對於cGAS產物2&39;-cGAMP的高親和力識別至關重要，而細菌STING受體的顯著特徵是無法識別哺乳動物2&39;-cGAMP。

細菌STING主要是與Toll/Interleukin-1 receptor（TIR）適配結構域以融合形式出現，或更罕見地附加到預測的跨膜片段上。已知TIR結構域可在植物和動物免疫反應中充當NAD +水解酶，因而研究人員測試了糞便鞘氨醇桿菌（Sphingobacterium faecium）全長TIR-STING融合蛋白（SfSTING）的催化功能，並觀察到NAD +迅速水解為煙醯胺和腺嘌呤二磷酸核糖。由於細菌的TIR-STING激活需要<100 nM c-di-GMP，研究人員在合成c-di-GMP的大腸桿菌細胞中表達了SfSTING，並觀察到有效的生長抑制作用。這些結果提示，細菌STING在CBASS介導的免疫反應中作為c-di-GMP響應的 NADase效應子。

此外，研究人員發現環二核苷酸識別可驅動細菌STING寡聚化，且負染電鏡分析表明，SfSTING僅在存在c-di-GMP的情況下才能形成穩定的細絲。在沒有細絲形成的情況下，所有的SfSTING NADase活性都會喪失，這一結果證實c-di-GMP誘導的寡聚化對於TIR結構域激活和效應子功能是必不可少的。

最後，研究人員根據結構分析構建103個細菌和492個後生動物的STING蛋白的系統發育樹，以比對STING在不同物種間的功能性和適應性，並確認固有免疫中環二核苷酸傳感的起源模型（見下圖2）。首先，通過對細菌、牡蠣、海葵和人類STING晶體結構的直接比較，揭示細菌與後生動物之間特定的環狀二核苷酸接觸的保守性以及磷酸二酯鍵識別的關鍵差異。隨後，研究人員進一步確認太平洋長牡蠣的全長TIR-STING融合體的2.4 Å晶體結構，發現與最近對人類STING的冷凍電鏡分析不同【11】，在存在2&39;-cGAMP的情況下，連接牡蠣STING和TIR結構域的接頭並未觀察到180°旋轉，而是STING與TIR的單體接觸發生重排，TIR結構域向下旋轉4°。此外，在環狀二核苷酸存在的情況下，牡蠣TIR-STING並未表現出催化NAD +裂解活性。以上結果均表明STING蛋白在後生動物中的適應性，並提示STING環狀二核苷酸感測如何在結構上傳遞給附加的效應子模塊。

圖2，STING結構比對分析表明固有免疫中環二核苷酸傳感的起源模型

總體來看，這項研究提出了以下幾個有趣的觀點：

1）細菌STING蛋白作為c-di-GMP的受體，主要在擬桿菌屬的基因組中編碼，而擬桿菌類則隨著人類和動物微生物群落的富集而生長；

2）c-di-GMP是第一個發現的人類STING配體，人類STING對細菌環狀二核苷酸的識別對於免檢測細胞內病原體（如單核細胞增多性李斯特氏菌）至關重要。因此，獲得作為c-di-GMP受體的STING可以提供直接選擇優勢，使動物細胞能夠通過檢測原核生物中保守的環二核苷酸第二信使來感知細胞內細菌；

3）文章中通過結構分析定義了環狀二核苷酸結合口袋突變，該突變使後生動物STING適應內源性2&39;-cGAMP信號的識別，並為後生動物STING特異性插入的出現引發自噬和I型幹擾素依賴性反應提供解釋。

綜上所述，這項研究定義了在細菌和人類細胞中共享的STING依賴性信號傳導的保守機制，並通過統一模型來解釋動物固有免疫中環狀二核苷酸感測的發生。綜合先前在原核生物抗病毒免疫中鑑定出的多種cGAS同源物[5, 12, 13]，細菌中STING的功能保守性揭示了控制人類cGAS-STING信號傳導的每個核心蛋白成分均來自古老的噬菌體防禦機制。

原文連結

https://www.nature.com/articles/s41586-020-2719-5

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參考文獻

1, Ishikawa, H. & Barber, G. N. STING is an endoplasmic reticulum adaptor that facilitates innate immune signalling. Nature 455, 674–678 (2008)

2, Joshua-Tor, L. & Hannon, G. J. Ancestral roles of small RNAs: an Ago-centric perspective. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 3, a003772 (2011).,

3, Swarts, D. C. et al. DNA-guided DNA interference by a prokaryotic argonaute.Nature 507, 258–261 (2014).,

4, Olovnikov, I., Chan, K., Sachidanandam, R., Newman, D. K. & Aravin, A. A. Bacterial argonaute samples the transcriptome to identify foreign DNA. Mol. Cell51, 594–605 (2013).

5, Cohen, D. et al. Cyclic GMP-AMP signalling protects bacteria against viral infection. Nature 574, 691–695 (2019)

6, Ouyang, S. et al. Structural analysis of the STING adaptor protein reveals a hydrophobic dimer interface and mode of cyclic di-GMP binding. Immunity 36, 1073–1086 (2012).
7, Zhang, X. et al. Cyclic GMP-AMP containing mixed phosphodiester linkages is an
endogenous high-affinity ligand for STING. Mol. Cell 51, 226–235 (2013).
8, Kranzusch, P. J. et al. Ancient Origin of cGAS-STING Reveals Mechanism of Universal 2′,3′ cGAMP Signaling. Mol. Cell 59, 891–903 (2015).
9, Shang, G., Zhang, C., Chen, Z. J., Bai, X. C. & Zhang, X. Cryo-EM structures of STING reveal its mechanism of activation by cyclic GMP-AMP. Nature 567, 389–393 (2019)

10, Morehouse, B. R. , Govande, A. A. , Millman, A. , Keszei, A. F. A. , Lowey, B. , & Ofir, G. , et al. (0). Sting cyclic dinucleotide sensing originated in bacteria. Nature.

11, Shang, G., Zhang, C., Chen, Z. J., Bai, X. C. & Zhang, X. Cryo-EM structures of STING reveal its mechanism of activation by cyclic GMP-AMP. Nature 567, 389–393 (2019)

12, Whiteley, A. T. et al. Bacterial cGAS-like enzymes synthesize diverse nucleotide signals. Nature 567, 194–199 (2019).

13, Lowey, B., Whiteley, A. T., Keszei, A. F. A., Morehouse, B. R., Mathews, I. T., Antine, S. P., Cabrera, V. J., Kashin, D., Niemann, P., Jain, M., Schwede, F., Mekalanos, J. J., Shao, S., Lee, A. S. Y. & Kranzusch, P. J. CBASS Immunity Uses CARF-Related Effectors to Sense 3′-5′- and 2&A0A0A0; --tt-darkmode-color: A0A0A0; --tt-darkmode-color: #A0A0A0;"> (2020) 182, 38–49 e17