基於擴增子與GeoChip 5.0 聯合分析的噬菌體與原核微生物群落研究

2021-01-21 美格基因

Bacteriophage-prokaryote dynamics and interaction within anaerobic digestion processes arcoss time and space

Junyu Zhang, Qun Gao, Qiuting Zhang, Tengxu Wang, Haowei Yue, Linwei Wu1, Jason Shi, Ziyan Qin,Jizhong Zhou, Jiane Zuo and Yunfeng Yang

雜誌：Microbiome

發表時間：2017年5月

影響因子：8.4973

一、背景

噬菌體與原核生物的動態變化和相互作用被認為是影響微生物群落組成和生態系統功能的重要因素，但我們目前對噬菌體與原核生物群落組成的時空變化還知之甚少，這使得我們不能精確地了解他們角色和影響。厭氧沼氣池由於容易獲取，操作穩定，具有營養豐富的環境，含有大量的噬菌體和原核細胞，因此被認為是測定噬菌體與宿主相互作用的理想模式系統。

二、材料和方法

本文從不同地理分布選取了中國三個地方的汙水處理廠的4個厭氧沼氣池（中國北部的北京1個、中國中部的山東青島1個、中國南部的浙江寧波2個，除寧波有一個厭氧沼氣池的發酵溫度為高溫，其餘均為常溫），從2012年10月至2013年9月，每月進行一次採樣。對採集的樣品進行物理化學檢測，包括Fe、Cu、Cr、SO42-、Cl-、NH4+-N和pH及過程性能指標TS、VS和COD；提取DNA，基於MiSeq平臺進行16S rDNA V4區測序，並用包涵455種噬菌體探針的Geochip 5.0探測噬菌體基因。然後對獲得的序列信息進行一系列的分析。

三、結果

1、噬菌體與原核微生物隨著功能的時空變化而動態變化

共獲得56143個原核微生物OTUs和來自78種噬菌體的183種噬菌體基因，其中91種噬菌體基因普遍存在於四個厭氧沼氣池中，且其相對豐度是只在平均單個厭氧沼氣池中出現的基因2.4倍，說明優勢噬菌體在不同地點是普遍存在的。

圖1 基於噬菌體在厭氧沼氣池中出現頻率的比例圖

單個噬菌體在時間尺度上的變化非常大，表明在激活汙泥的過程中有大量的噬菌體產生和消亡，揭示了噬菌體在汙泥環境中高度活躍。

圖2 (A) 噬菌體豐度、 (B) 原核微生物豐度、 (C) 噬菌體α多樣性、(D) 原核微生物α多樣性的時空變化

註：BJ: Beijing samples; QD: Qingdao samples; Ningbo-M: samples from Ningbo anaerobic digester maintained at mesophilic temperature, and Ningbo-T: samples from Ningbo anaerobic digester maintained at thermophilic temperature.

2、噬菌體對原核微生物群落自上而下的控制

對原核微生物OTUs跟噬菌體的豐度進行分析，圖3（a）中可以看到原核微生物跟噬菌體的豐度之間的相關性雖然不是非常強，但噬菌體的豐度是隨著原核微生物的豐度增大而增大。（b）、（c）分別是原核微生物OTUs跟噬菌體間α多樣性和β多樣性的相關分析，發現兩者間的β多樣性相關性非常強。

另外通過多元回歸矩陣分析，發現噬菌體作為一種生物影響因子，對原核微生物群落組成的影響高達40.6%。說明噬菌體對塑造細菌群落結構起著非常重要的作用。

圖3 噬菌體與原核微生物(a)豐度、(b)α多樣性、(c)β多樣性的斯皮爾曼相關分析（相關性由P<0.050決定）

表1 非生物因素與生物因素對原核微生物群落組成影響的多元回歸矩陣分析結果

3、噬菌體對過程性能的影響

通過最小二乘法模型分析噬菌體、原核微生物和過程參數之間的關係，發現噬菌體對生物氣體的生成、揮發性固體含量影響很大，雖然原核微生物對這些過程參數的變化也有重要的影響，但沒有噬菌體的影響顯著。

圖4 噬菌體和原核微生物對過程性能的影響

註：箭頭上的數字是最小二乘模型的相關係數R2，***P<0.001，**P<0.010，*P<0.050

為將噬菌體、微生物群落和厭氧消化的過程性能聯繫起來，進行了通路分析。從圖5中可以看到有4條重要的通路。

圖5 將噬菌體和微生物群落與厭氧沼氣池關聯起來的生物化學通路分析

註：微生物群落用紫色表示，中間代謝產物用綠色表示，甲烷和揮發性固體用紅色表示，通路用箭頭表示

第一條通路是噬菌體侵染宿主的通路。長尾噬菌體、肌尾噬菌體、短尾噬菌體這三種噬菌體主要侵染的是廣古菌門的古菌，在本次的樣品中所有的廣古菌門微生物都是產甲烷古菌。長尾噬菌體、肌尾噬菌體、短尾噬菌體這三種噬菌體的密度跟廣古菌門微生物平均豐度的相關性很強（圖6），這就說明噬菌體對甲烷的產生具有很大的影響。

第二條通路中噬菌體裂解細菌，會增加厭氧發酵過程中有機物的量，這對初級生產具有正反饋的作用。

第三條通路顯示厭氧反應池中原有的或細菌裂解產生的有機物通過厭氧發酵轉化成乙酸鹽，然後被甲烷化產生甲烷。

第四條通路顯示的是未被微生物分解的有機物從厭氧發酵池流出後變成揮發性固體。

圖6 古菌噬菌體基因平均信號密度與廣古菌門平均豐度相關性圖（N=46）

4、噬菌體與原核微生物間的網絡分析

圖7 噬菌體和原核微生物OTUs組成的關係網絡

註：網絡連接的正相關與負相關是由兩個節點之間的斯皮爾曼相關性的正負決定的，正相關用紅色表示，負相關用藍色表示，連線的寬度代表斯皮爾曼相關係數的大小

基於斯皮爾曼相關性構建噬菌體與原核微生物之間複雜的關係網絡，雖然原核微生物有55個OTUs超過了噬菌體基因數，但這也表明兩者之間的相互作用強而穩定。

從圖中可以看到一半的連接都是細菌之間的，佔了50.7%，噬菌體與細菌之間的連接只有30.7%，噬菌體之間的連接佔18.6%。

其中有好幾個腸桿菌噬菌體在網絡中作為重要的節點，連接很多變形桿菌，所連接的細菌大多屬於叢毛單胞菌科、紅環菌科、紅桿菌科而非腸桿菌科。這可能說明這些細菌是共居的，或者說這些腸桿菌噬菌體可侵染的宿主很多。除13a之外，腸桿菌噬菌體跟細菌之間的連接都是正相關的，而只有Aeromonas phage phiO18P, Aeromonas phage Aeh1,and Mycobacterium phage Che12則跟細菌之間呈現負相關的連接。基本上所有噬菌體-噬菌體之間的連接都是正相關的，意味著共侵染和共居的可能性。

四、小結

通過先進的高通量技術，對中國4個汙水處理廠厭氧沼氣池的噬菌體和原核微生物群落組成進行檢測，雖然生物氣體的產生在整個過程相對穩定，但噬菌體和原核微生物群落在整個研究過程中呈現月度性波動，表明兩者間的α和β多樣性存在非常重要的相關性。其中非常突出的是噬菌體對原核微生物群落組成變化的解釋度達到40.6%，遠高於非生物因素的14.5%。結果表明，噬菌體與過程性能包括生物氣體產量和揮發性固體的濃度有非常重要的聯繫。

五、結論

噬菌體是控制原核微生物組成和過程性能的主要生物因子。因此，噬菌體在塑造原核生物群落動力學和厭氧消化的過程性能方面可能發揮更大的作用。

六、文章亮點

以厭氧沼氣池為模型，基於 16S rDNA 擴增子測序結合GeoChip 5.0 晶片技術探索噬菌體與原核微生物在厭氧消化過程中時間和空間的動態變化和互作， 並通過網絡圖分析，揭示兩者關聯，數據挖掘充分，分析討論有理有據。

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