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基於PacBio SMRT三代測序的紅樹林沉積物真菌群落的研究
Analysis of Fungal Community in Mangrove Sediments Based on PacBio SMRT Sequencing
張志鋒1，李猛1 *
1高等研究院，深圳大學，深圳，廣東
*通訊作者郵箱：limeng848@szu.edu.cn
摘要：雖然二代測序可以在短時間內產生大量高質量的數據，但由於讀長原因，測序結果並不能準確的鑑定到種水平，因而在環境微生物群落的鑑定上仍存在一定的局限性。以circular consensus sequencing (CCS) 技術為基礎的PacBio SMRT的三代測序技術，可以產生長度可達十至數十kb的高質量DNA數據，能夠完整的覆蓋細菌16S rDNA，真菌18S/28S rDNA和ITS區域，甚至18S rDNA+ITS+28S rDNA區域全長，可以有效的解決注釋精度的問題。在本研究中，通過紅樹林沉積物樣品採集，DNA提取，PCR擴增，PacBio SMRT測序和數據分析，最終獲得高注釋精度的真菌群落OTU table。以此為基礎，通過後續的生態學分析，對紅樹林真菌群落的多樣性、組成、分布規律、影響因素、群落組裝過程、物種相互作用關係等方面有深刻認識。分析方法部分同樣適用於其他環境微生物群落PacBio SMRT三代擴增子測序數據的分析。
關鍵詞：PacBio SMRT，真菌群落，擴增子測序
材料與試劑
1.DNeasy PowerSoil Kit (Qiagen, 12888-50/12888-100) 或 FastDNA Spin Kit for soil (MP Biomedicals, 116560)
2.PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (Takara, R050) 或 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Thermo Scientific, F537L)
3.無菌超純水
儀器設備
1.沉積物採樣器
2.渦旋振蕩器 (帶適配器) /組織研磨儀 (MP Biomedicals, MP Fastprep-24 5G)
3.NanoDrop ND-2000c UV-Vis spectrophotometer (NanoDrop Technologies)
4.ProFlex™ PCR儀 (ThermoFisher)
軟體和資料庫【可選】
1.軟體
pbccs (v4.02, https://github.com/PacificBiosciences/ccs)
BAM2fastx (https://github.com/pacificbiosciences/bam2fastx/)
lima (v1.11.0, https://github.com/pacificbiosciences/barcoding/)
flexbar (v3.0, https://github.com/seqan/flexbar)
mothur (v1.44.2, https://github.com/mothur/mothur/releases/tag/v1.44.2)
vsearch (v2.15.0, https://github.com/torognes/vsearch/releases/)
ITSx (v1.0.11, https://microbiology.se/software/itsx/)
usearch (v10.0.240, https://drive5.com/usearch/)
BLAST+ (v2.10.1, https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/)
RAxML (v8.2.12, https://github.com/stamatak/standard-RAxML)
IQTree (v2.1.1, http://www.iqtree.org)
FastTree (v2.1.11, http://www.microbesonline.org/fasttree/)
2.資料庫
UNITE (v8.2, https://doi.org/10.15156/BIO/786372) for ITS
silva (release 138, https://www.arb-silva.de/documentation/) for 16S/18S rDNA
UCHIME reference dataset (v7.2, https://unite.ut.ee/repository.php)
實驗步驟
1.樣品採集與處理
1.1樣品採集
根據實驗目的設計合理的實驗方案，選擇要採集的紅樹林，確定採樣位置。紅樹林樣品的採集使用特製的沉積物樣品採樣器，沉積物樣品的採集使用三點或五點取樣法。對每個樣點的3-5個重複樣品進行等量混合以減少採樣偏差。根據實驗需要可對樣品按深度分層，使用無菌自封袋保存。樣品需使用冰袋或乾冰冷藏運輸，實驗室內存放於-40/-80 °C冰箱。
1.2DNA提取
參考所使用試劑盒說明書進行。若使用DNeasy PowerSoil Kit，可在機械破碎後增加60 °C水浴30 min，可提高DNA產量。使用NanoDrop確定DNA質量和濃度，並1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。質量不好的DNA應重提或使用DNA純化試劑盒進行純化。
2.PCR擴增與PacBio SMRT測序
2.1Primers選擇
選擇合適的Primer是研究微生物群落的最重要步驟。對於真菌群落的研究通常選用ITS區域。對於ITS全長的擴增，建議優先選用對真菌群落具有極高覆蓋度的引物ITS9Munngs/ITS4ngs (Tedersoo and Lindahl, 2016; Nilsson, et al., 2019) 。若上述引物擴增效果較差，可根據情況選用ITS1Fngs/ITS4ngs (White et al., 1990; Tedersoo et al., 2015 ) 或ITS1F/ITS4 (White et al., 1990; Gardes and Bruns, 1993) 。根據後續測序過程中的混樣方案，在正反向引物上下遊添加特異barcode信息，barcode長度不小於6 bp，以保證測序後數據的正確拆分。
2.2PCR擴增
PCR擴增中嵌合體的形成與循環數，聚合酶的選擇和初始模板質量有很大關係，特別是長片段擴增中更容易出現嵌合體。建議選擇高活性高保真度的DNA聚合酶，延長延伸時間 (Tedersoo et al., 2015) 。雖然循環數的增加容易導致嵌合體產生，但擴增效率也會隨著片段長度的增加而下降，因而循環數的選擇一定要慎重。ITS片段擴增的循環數可以設置為30-32個，不超過35個，當片段長度增加時可以適當增加循環數 (Tedersoo et al., 2015; Nilsson et al., 2019) 。PCR擴增前將DNA模板稀釋到5-10 ng/μl，以保證擴增過程中模板的一致性。由於三代測序所需DNA量較大，PCR擴增體系可選擇30 μl，其中包含1.5U polymerase，3 μl buffer，150 μM dNTPs，正反向引物各0.12 μM，2-10 ng DNA模板。PCR擴增程序為，94 °C 5 min, 94 °C 30 s, 57 °C 30 s, 72 °C 1 min 20 s, 72 °C 10 min，其中2-4步為32循環。PCR產物使用NanoDrop和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。每個樣品至少設置3個重複，並將其等量混合，在以減少PCR偏差。同時每批次PCR都應設置空白對照。
2.3PacBio SMRT測序
此步驟主要由測序公司完成，簡單步驟如下：將加有barcode的PCR產物按照預先設計的混樣方案等量混合，然後將發卡測序接頭連接到PCR文庫並完成環化。使用Enzyme Clean Up Kit對測序文庫進行純化。將測序引物退火結合至PCR產物文庫，並將DNA 聚合酶結合測序模板。測序使用PacBio Sequal平臺進行。
3.數據分析
3.1CCS (circular consensus sequencing) reads
PacBio SMRT 通過對環化連接的插入測序片段循環進行多次測序後比對校正糾錯，獲得高精度的保守序列 (CCS reads) 。當循環測序數達到5次時，CCS reads的質量理論上可以達到QC40，也就是錯誤率0.01%。PacBio平臺產生數據格式為.bam，使用pbccs軟體進行環化校正得到CCS reads，命令為ccs cell01.subreads.bam cell01.ccsreads.bam --minPasses 5 --reportFile ccs_report.txt。原始文件為cell01.subreads.bam，輸出文件為cell01.ccsreads.bam，--minPasses為循環數，--reportFile為統計結果文件。
3.2數據拆分 (demultiplex)
準備barcode文件 (Barcode.fasta) ，根據barcode信息，使用lima軟體進行樣品拆分：lima --ccs cell01.ccsreads.bam Barcodes.fasta split.bam --same --split-bam --split-bam-named -j 100。其中split.bam文件為輸出文件，輸出文件將以split.xxx.bam命名，--same表示雙端引物相同，--split-bam表示按照barcode pairs拆分bam文件，--split-bam-named表示按照barcode名稱對拆分後輸出的bam文件命名，-j線程數。另外可先進行步驟3.3 bam轉fastq，將cell01.ccsreads.bam文件轉換為fastq文件後，根據barcode序列，使用flexbar軟體 (Dodt et al., 2012) 進行拆分，命令為flexbar -b Barcodes.fasta -r cell01.ccsreads.fastq -t cell01.ccsreads -bt ANY -be 0.1，-b為barcode序列文件，-r為需要拆分的fastq文件，-t為輸出文件前綴，-bt為--barcode-trim-end，ANY表示刪除barcode兩端序列，-be為--barcode-error-rate。
3.3bam轉fastq
使用BAM2fastx軟體進行。bam2fastq -o sample1 sample1.ccsreads.bam -u。-o為輸出文件前綴，sample1.ccsreads.bam為輸入bam文件，-u表示輸出文件不壓縮。
3.4質控過濾
使用mothur ( Schloss et al., 2009) 進行質控過濾，首先將fastq拆分為序列文件及其對應的質量分數文件fastq.info(fastq=sample1.fastq)，隨後進行質控trim.seqs(fasta=sample1.fasta,minlength=100,maxambig=0,maxhomop=12,qfile=sample1.qual,qwindowsize=50,qwindowaverage=20)。
3.5文件及序列重命名
批量修改文件名以後使用usearch (Edgar., 2010) 對序列按照文件名進行重命名，usearch11 -fastx_relabel sample1.fasta -prefix sample1- -fastaout sample1_relabel.fasta -keep_annots。-prefix為重命名序列前綴，-fastaout為輸出文件名。
3.6提取ITS序列
使用ITSx (Bengtsson-Palme et al., 2013) 進行提取。命令為ITSx -i sample1_relabel.fasta -o sample1_out --cpu 4 --save_regions all --preserve T -E 1e-2。-i輸入文件名，-o輸出文件名，--cpu核心數，--save_region要保留的片段，all表示保留所有片段，包括18S，28S，ITS全長，ITS1，5.8S和ITS2，--preserve序列名為原始序列名，-E，e-value。此步驟產生的sample1_out.full.fasta文件為ITS全長序列，用於後續分析。
3.7嵌合體檢測與刪除
使用vsearch (Rognes et al.,2016) 進行重頭嵌合體檢測uchime_denovo (Edgar et al., 2011) 和基於資料庫的嵌合體檢測uchime_ref。uchime_denovo命令：vsearch --uchime_denovo sample1_out.full.fasta --chimeras sample1_out.full_chimeras.fasta --nonchimeras sample1_out.full_nonchimeras.fasta --relabel_keep；uchime_ref命令：vsearch --uchime_ref sample1_out.full_nonchimeras.fasta --chimeras sample1_out.ful_chimeras2.fasta --nonchimeras sample1_out.full_nonchimeras2.fasta --db uchime_reference_dataset_28.06.2017.fasta --relabel_keep --threads 25。重命名文件sample1_out.full_nonchimeras2.fasta為sample1.fasta用於後續分析。
3.8長度篩選
絕大部分真菌ITS片段的長300-900 bp，極少數擔子菌可達到1,100 bp ( Schoch et al., 2014; Nilsson et al., 2019) 。為避免過長或過短序列幹擾，使用vsearch進行片段長度篩選。vsearch --fastx_filter sample1.fasta --fastaout sample1.remian.fasta --fastaout_discarded sample1.discarded.fasta --fastq_maxlen 900 --fastq_minlen 300。
3.9OTU生成與代表序列挑選
主要使用usearch，但由於免費版32位usearch限制，在處理大數據量時結合vsearch共同使用。此步驟可以分為以下步驟：
1)計數與去重
usearch -fastx_uniques sample1.remian.fasta -fastaout uniques.sample1.fasta -sizeout
2)去除單條序列
usearch -sortbysize uniques.sample1.fasta -fastaout desingl.uniques.sample1.fasta -minsize 2。-minsize表示保留序列的最小條數。
註：以上兩步可以在vsearch中合併為一步，vsearch --derep_fulllength sample1.fasta --sizein --fasta_width 0 --sizeout --output desingl.unique.sample1.fasta --minuniquesize 2 --threads 8。
3)OTU聚類
usearch10 -cluster_otus desingl.uniques.sample1.fasta -otus sample1.otu.fasta -uparseout sample1.otu.txt -relabel OTU -minsize 2。-otus sample1.otu.fasta輸出即為OTU代表序列，usearch10默認選擇豐度最高的序列為代表序列。usearch10默認使用UPARSE算法 (Edgar., 2013) 進行OTU聚類，序列相似度閾值為97%，不能更改。若想更改相似度閾值，可選擇usearch10以前的早期版本，通過-id 0.97參數進行修改。常用的OTU聚類方法還有CD-HIT等方法 (Fu et al., 2012) ，此處不再贅述。
4)OTU table生成
vsearch --usearch_global sample1.fasta --db sample1.otu.fasta --id 0.97 --otutabout sample1.otutable.txt --threads 50。以步驟3.9.3產生的OTU代表序列的資料庫 (-db) 對樣品數據以97%相似度 (-id) 為閾值進行聚類生成OTU table。
3.10 代表序列注釋
使用軟體為BLAST+，真菌ITS使用UNITE資料庫。有研究表明早期的UNITE資料庫中有許多序列都是錯誤鑑定的，將一些非真菌生物鑑定為真菌，主要為Rozellomycota和一些未知真菌。最新版的UNITE資料庫分為真菌和真核兩種，真菌資料庫主要為真菌序列，真核資料庫主要為真核序列，真核資料庫相比於真菌資料庫更加全面準確，因而建議使用真核資料庫。構建資料庫：makeblastdb -in UNITE_eukaryotes_all_04.02.2020.fasta -dbtype nucl -out unite_eukaryotes。-dbtype nucl表示資料庫類型為核酸序列。注釋：blastn -max_target_seqs 10 -db unite_eukaryotes -out otu.rep.seq.euk.blast -query sample1.otu.fasta -num_threads 10 -outfmt "6 qseqid qlen qstart qend salltitles sseqid slen sstart send qcovs bitscore evalue pident"。-max_target_seqs輸出比對結果數量，-out輸出比對結果文建，-query輸入代表序列文件，-num_threads核心數，-outfmt輸出文件格式，6表示表格格式，後面內容為比對結果信息。為使注釋結果更加可靠，採用Tedersoo等人 (2015, 2018) 使用的注釋策略，對於注釋在真菌界中的OTU，以90%、85%、80%和75%的序列相似度分別作為屬、科、目和綱的區分標準。
3.11系統發育注釋 (可選)
相比於二代測序而言，三代測序獲得的更長的微生物maker基因序列可以獲得更為精確的注釋結果。但是由於人們目前對自然界微生物認識有限，現有資料庫中許多微生物並未精確注釋，如UNITE真核生物資料庫中有許多序列被注釋為「Eukaryota_kgd_Incertae_sedis」，同時有許多序列僅通過數十至上百bp的的alignment進行了注釋，結果不夠準確，而且有許多未知微生物的序列並未被包括在資料庫中。因而我們提出了基於blastn注釋結果的「基於系統發育分析的微生物鑑定」，以更準確的對未知真菌進行注釋。簡單來說就是使用3.93中獲得OTU代表序列 (或去除其它真核序列的真菌OTU代表序列) 構建系統發育樹。常用構建系統發育樹的方法有Neighbor Joining (NJ) ，Maximum Parsimony (MP) ，Maximum Likelihood (ML) 和Bayesian inference (BI) ，幾種方法各有優勢。此處推薦使用ML方法構建系統發育樹，推薦軟體有FastTree (號稱速度最快的ML樹構建軟體，一般來簡單觀察系統發育關係，數據量特別大時使用) (Nguyen et al. 2015)，IQTree (一種精確快速的ML系統發育分析工具，bootstrap計算速度是RAxML的10-40倍，大數據量時強烈推薦) (Price et al. 2010)，和RAxML (最常用的系統發育樹構建軟體之一，支持多線程和向量指令運行，運行速度較快，數據量不是特別大時推薦使用) (Stamatakis 2014)，請根據情況酌情選用。序列比對使用MUSCLE (Edgar 2004) ：muscle -in input.ITS.fas -out aligned.input.ITS.muscle.fas；其中-in為輸如fasta序列；-out為輸出alignment文件。序列修剪使用trimAl (Capella-Gutierrez et al. 2009) ：trimal -in aligned.input.ITS.muscle.fas -out aligned.input.ITS.muscle.trim.phy -gt 0.1；-in為輸如fasta序列；-out為輸出alignment文件；-gt序列中允許出現gap的部分。IQTree構建系統發育樹：iqtree -s aligned.input.ITS.muscle.trim.phy -m TESTONLY -nt 60 -bb 1000 -alrt 1000；-s為輸入alignment文件；-nt為核心數，也可設為AUTO系統自動分配；-bb (ultrafast bootstrap approximation)重複抽樣次數，默認1000，大數據建議-bb，小數據可用-b；-alrt 是否啟用SH-aLRT檢驗，可刪除；-m，model，不提供時iq-tree自動選擇；-o可指定外群序列。FastTree構建系統發育樹：FastTree aligned.input.ITS.muscle.trim.phy > aligned.input.ITS.muscle.trim.tree；數據量特別大時使用。RAxML構建系統發育樹：raxmlHPC-PTHREADS-SSE3 -T 40 -f a -x 12345 -# 1000 -m GTRGAMMA -s ./BAE61387_aligned_sequences.fas.phy -n tre；若CPU支持也可選用raxmlHPC-PTHREADS-AVX或raxmlHPC-PTHREADS-AVX2，可以極大提高運行速度；-T 線程數；-f 選擇RAxML算法，a為快速bootstrap分析；-x隨機數；-# bootstrap；-m，model，DNA序列常用為GTRGAMMA；-s 輸入文件名；-n 輸出文件後綴。構建完成系統發育樹後，根據OTU所在的系統發育分枝對OTU進行相應的初步注釋。
4.數據統計與分析
基於步驟3所獲得的代表性序列和OTU table對真菌群落的α多樣性、β多樣性、生物地理學特徵、分布與群落結構的影響因素，群落結構的組裝過程、共現性關係等內容進行分析與可視化展示，此部分內容繁多，本文中不再贅述。
致謝
本工作由科技部基礎資源調查專項 (2019FY100700) 、國家自然科學基金 (91851105、31970105) 及中國博士後科學基金 (2020M672779) 資助。本文分析方法已應用於待發表文章「Pacific Biosciences single-molecule real-time (SMRT) sequencing reveals high diversity of basal fungal lineages and stochastic processes controlled fungal community assembly in mangrove sediments」。
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