COM：根系微生物組研究中的合成群落還原法

新聞稿

中科院遺傳發育所發表「重組菌群體系在根系微生物組研究中的應用」的重要綜述

微生物學權威雜誌《Current Opinion in Microbiology》雜誌發起的Environmental Microbiology專題，特邀植物微生物組領域的14個團隊系統總結植物微生物組在乾旱、免疫、進化和研究方法等方面(14個主題見下文)的最新進展和末來的研究方向。

植物根係為微生物提供大量聚集棲息和繁衍的場所。這些微生物及其相互關系統稱為根系微生物組。根系微生物組伴隨著植物的整個生長周期，幫助植物吸收營養、抵抗病害和適應脅迫環境。根系微生物組研究目前主要以描述性研究為主，重組菌群體系為研究根系微生物組與宿主植物互作的功能和機制提供了前所未有的機遇。

中科院遺傳發育所白洋課題組應邀發表了根系微生物組研究中合成菌群體系的綜述文章Reductionist synthetic community approaches in root microbiome research。總結了合成菌群體系在植物根系微生物組功能研究中的應用。主要包括：一、分離培養根系微生物組菌種資源；二、比較主流植物無菌種植研究體系的優缺點；三、合成菌群體系在根系微生物組研究中應用的經典案例（重現自然土壤的實驗結果，研究根系微生物組的功能，研究微生物與微生物之間的關係）。文章也指出當前研究方法的不足，展望了未來需要解決的問題。

白洋課題組長期進行植物與根系微生物組互作的研究，近期在Science、Nature Biotechnology等雜誌發表相關研究重要成果。該綜述於2019年11月14日在線發表於Current Opinion in Microbiology雜誌(https://doi.org/10.1016/j.mib.2019.10.010)。工程師劉永鑫為該論文第一作者，白洋研究員為通訊作者，在讀博士生秦媛參與了部分工作。該研究得到了中國科學院戰略性先導科技專項、前沿科學重點研究項目、國家自然科學基金面上項目和中國科學院微生物組項目的支持。

根系微生物組研究中的合成群落還原法

Reductionist synthetic community approaches in root microbiome research

Current Opinion in Microbiology[8.134]

2019-11-14，Review

原文連結：https://doi.org/10.1016/j.mib.2019.10.010

第一作者：Yong-Xin Liu(劉永鑫)^1,2,3

通訊作者：Yang Bai(白洋)^1,2,3,4

合作作者：Yuan Qin(秦媛)^1,2,3,4

主要單位：

1. 中國科學院遺傳與發育生物學研究所，植物基因組學國家重點實驗室 (State Key Laboratory of Plant Genomics, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China)

2. 中國科學院大學，生物互作卓越創新中心(CAS Center for Excellence in Biotic Interactions, University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

3. 中國科學院遺傳與發育生物學研究所，中國科學院-英國約翰英納斯中心植物和微生物科學聯合研究中心(CAS-JIC Centre of Excellence for Plant and Microbial Science (CEPAMS), Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences (CAS), Beijing 100101, China)

4. 中國科學院大學，現代農學院 (University of Chinese Academy of Sciences, College of Advanced Agricultural Sciences, Beijing 100049, China)

摘要

合成群落(Synthetic community，簡稱SynCom)方法，是研究有關植物如何調控其微生物群落、以及微生物組如何影響植物生長和健康的功能和機理的有效手段。微生物的培養和重組在此過程中起著關鍵作用，這使研究人員能夠在可控的實驗室條件下可重複研究植物與大部分與植物相關微生物之間的相互作用。在這裡，我們總結了在植物微生物組研究中使用SynCom實驗的出現、當前的成就和未來的機會，關注的重點是與植物根相關的細菌。

引言

註：••代表強烈推薦的參考文獻；•代表推薦的參考文獻；參考文獻部分也會對這些推薦文獻進行簡要介紹

獨特的微生物組聚集在植物根部，微生物成員來自土壤環境[1••-3••]，詳見《Nature: 擬南芥根微生物組的結構和組成》。這些微生物在其整個生命周期中與植物相互作用[4,5]，詳見《水稻微生物組時間序列分析》，影響植物的生長[6,7••]，養分吸收[8••，9••]和抗病性[10••-13•]。在過去的十年中，已經在模式植物[1••，3••，14]和農作物[10••，15••-19]中廣泛研究了根部微生物組的組成。此外，研究人員從各種植物的微生物群落中培養細菌並建立資源庫，包括擬南芥、水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）、番茄（Solanum lycopersicum）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）、三葉草（Trifolium pratense）和甘蔗（Saccharum sp.）[8••，10••，18,20••，21••-23]等。培養這些細菌的最終目標是檢查根系微生物群與宿主植物之間相互作用的功能和機理。在這裡，我們討論在實驗性使用合成群落（SynComs）的主要挑戰，即微生物組培養和重組。

從整體主義到還原主義

From holism to reductionism

根系微生物組與宿主植物之間相互作用的研究，架起了微生物生態學和植物分子生物學領域的橋梁。生態學研究通常使用整體方法研究根微生物組，這對於揭示自然環境中根微生物組的狀態至關重要。相比之下，使用還原論方法的研究試圖避免不可控制的變量，將根微生物組與植物宿主的相互作用分解為實驗可控制的因素（培養的微生物，營養素，植物基因型等），以了解其功能和機制[ 24•]（圖1）。兩篇具有開創性的論文在根微生物學研究中率先提出了還原論的概念[1••，3••]。這些研究的作者在受控條件下和在天然土壤中生長擬南芥植物，以避免風，雨和溫度的差異，同時允許植物從天然土壤微生物群落中組裝根微生物組（圖1a，b）。通過大量的生物學和技術重複，兩項研究得出的結論是：與土體土壤的微生物組相比，擬南芥植物具有獨特的根系微生物組。此外，Bulgarelli等證明了在實驗室條件下天然土壤中根系微生物群的主要組裝模式與自然田間土壤中的根系微生物群落相似[1••]。

在溫室(受控條件)下研究天然土壤接種物中的根部微生物組的組裝已廣泛用於水稻，擬南芥及其近緣[15••，25•，26•]等物種的根部微生物組研究（圖1b）。減少環境變化對於有意義的微生物組比較描述至關重要。但是，為了通過實驗操作微生物組，必須將根微生物組和宿主植物之間的相互作用分解為實驗可控制的因素，例如微生物、植物基因型、營養素和生長條件（圖1c）。這要求研究人員培養特定的微生物[27]。

圖1. 在田間、溫室和實驗室合成群落系統中開展微生物組研究

（a）田間實驗用於探索自然條件下根系微生物組的組裝和變異，溫度，風，雨，微生物組和土壤養分等環境因素無法控制。

（b）在受控溫室內使用天然土壤進行的實驗可避免環境變化並提供可重複的結果。但使用此技術無法深入剖析微生物群成員和土壤養分。

（c）合成群落(SynCom)方法利用培養的微生物提供獨特的機會以獲得完全可重複的結果，並研究根部微生物組在植物適應性中的功能。

培養和剖析根系微生物組

Cultivating and dissecting the root microbiome

操縱微生物組的方法需要大量收集微生物培養物和植物無菌(axenic)生長系統[20••，28•，29••]。儘管成千上萬的培養微生物已被分離並保藏在一些國際菌種保存中心[30]，但這些微生物是從各種環境或宿主物種中獲得的，並且可能適應當地條件以及與天然微生物組的其他成分進行相互作用。因此，現有分離株可能與研究人員在其新樣品中發現的微生物在基因型和功能上有所不同，因此可能不適合在給定的天然土壤中剖析植物與根部微生物組之間的相互作用。

高通量細菌培養為大規模捕獲和操縱細菌群落提供了解決方案（圖2a–d）。最近，白洋等建立了用於高通量細菌培養和鑑定的實驗和分析流程，能夠從在自然土壤中生長的擬南芥植物的根和葉中分離和鑑定了7943個細菌分離物[20••]。這項技術主要涉及使用TSB、R2A等相關培養基以及限制稀釋方法，並輔以細胞分選和菌落挑選。使用基於454測序的方法的對細菌分離株進行了表徵，這使作者能夠鑑定出共同培養的菌株。該方法培養了可重複存在於擬南芥根和葉微生物組中細菌類群的50％以上。最近，張婧贏等人使用一種改進的鑑定方法鑑定來自水稻根的13,512種細菌分離株，覆蓋了70％的水稻根細菌微生物組成員。這種新方法使用Illumina HiSeq2500提高了測序深度，並通過使用兩端條形碼標籤(barcode)和每種分離物的獨立文庫製備避免了嵌合體形成，從而提高了鑑定的準確性[8••]。這些方法提供了一種剖析特定根微生物組樣品的有效方法，其優點是能夠識別共培養的細菌（即包含一種以上細菌的細菌「分離物」）。

為了獲得儘可能多的多樣性，有針對性的分離細菌（即，標準培養基不能滿足特定培養要求的細菌）是對高通量細菌培養的有效補充。基於16S rRNA基因測序或鳥槍法宏基因組測序的幾種方法可以幫助鑑定合適的專用分離培養基。例如，Oberhardt及其同事開發了一種工具KOMODO，詳見《NC：16S序列預測培養基配方》，可以使用細菌16S rRNA基因序列來預測所需的分離培養基[31]。另一個可用的資料庫中，使用Greengene ID，BugBase資料庫可用於獲取詳細的細菌特徵，例如有氧或無氧生長，從而為所需的培養條件提供指導[32]，詳見《Bugbase預測16S擴增子數據表型》。宏基因組學數據或細菌基因組提供了有關細菌碳水化合物代謝和抗生素抗性基因的第二個信息來源，這有助於設計富集特定細菌的分離培養基[33,34]。在宏基因組學數據的指導下，Kwak及其同事使用含有卡那黴素的海洋肉湯培養基成功分離了22種具有番茄抗青枯病的黃桿菌的菌株[10••]，詳見《NBT：根際微生物組抗番茄枯萎病 和 PPT思路梳理》。同時培養基製備技術也很重要，例如，Kato及其同事報告稱，高壓滅菌的磷酸鹽和瓊脂一起生成H₂O₂，從而減少了最終的菌落數[35]，詳見《再這麼配培養基，你的細菌都被毒死了！》。未來的培養工作應針對培養難以獲得的分類單元（即酸性細菌，嗜彎曲桿菌，變形桿菌和厭氧分類單元），這些分類單元普遍存在於根系微生物組中，但在收集培養物中並未得到很好的體現。

SynCom實驗中的首次通過表徵和分離株的選擇通常使用培養菌株的16S rRNA基因序列與微生物組分析數據進行交叉比對（圖2e）。在微生物組分析中，與使用97％ 16S rRNA基因序列相似性聚類的操作分類單元（OTU）相比，在UNOISE、DADA2和Deblur分析（主流非聚類方法dada2,deblur和unoise3介紹與比較）中獲得的擴增測序變體（ASV，100％16S rDNA序列相似性）提供了更高的解析度，詳見《擴增子分析還聚OTU就真OUT了》。ASV區分16S rRNA基因中的單核苷酸多態性。這樣可以更精確地比較培養細菌和擴增子數據[36-38]；然而，應該指出的是，儘管16S rRNA基因是最廣泛使用的分類標記，但並不能揭示細菌分離物中的所有基因組和功能變異。例如，Karasov及其同事證明了屬於同一OTU的假單胞菌分離株（基於16S rRNA基因序列）在基因組含量和疾病表型水平上表現出明顯的不同[39•]。因此，選擇具有相同16S rRNA基因序列但從不同根系分離，代表不同定殖事件的細菌菌株，將增加培養的根系微生物組成員的功能多樣性[8••，20••]，如《NBT封面：水稻NRT1.1B基因調控根系微生物組參與氮利用》中對不同品種來源的相同16S菌種序列各保留一個菌株。

圖2. 合成群落工作流程

Figure 2. SynCom workflow.

a. 採集帶有大量微生物組的植物根系

b. 採用挑單克隆、限制梯度稀釋和流式細胞分選等方法分離單菌

c. 採用雙向標籤的建庫方式採用Illumina對培養組進行高能量鑑定，同時對非冗餘菌進行16S全長Sanger測序

d. 純菌採用甘油冷凍保藏，構建的菌種庫可與自然樣品比對可用菌種的比例和相對豐度

e. 根據不同研究，主要依據菌種與實驗設計的相關分析、網絡分類及依賴分類學分布，來選擇實驗菌種

f. 功能分析。採用單菌或混菌的方法，在無菌體系中接種無菌苗，觀察表型的變化以及定量群落結構的變化

植物無菌培養系統的比較

Comparison of axenic systems

SynComs主要使用三種無菌系統：瓊脂基(agar-based)，黏土基質(clay-based)和FlowPot系統，每種系統都有各自的優缺點。瓊脂系統是高度人工的，許多因素（如營養水平以及生物和非生物脅迫）均受到控制[40••-42]。與瓊脂系統相比，基於粘土的系統可以更好地模擬土壤條件，因為粘土的質地類似於土壤。但是，粘土基質會影響養分狀況影響，使其難以去除氮或磷酸鹽等特定養分，並且粘土缺乏有機碳[8••，20••，43••]。FlowPot系統基於高壓滅菌和洗滌過的土壤，因此含有有機碳。但是在該系統中，營養成分無法控制[7••，29••]。因此，系統的選擇應基於實驗的最終目的。

合成群落法重組根系微生物組

Reconstituting root microbiomes using SynComs

利用培養的純菌株，科學家們能夠根據自然微生物組模式在無菌系統中合成群落(SynComs)，該模式是通過微生物與植物表型之間的相關性獲得的[10••]，以及野生型和突變體植物之間根系微生物群落的比較[ 43••]或網絡分析[7••]（圖2e）。這些方法為驗證在自然土壤條件下觀察到的根系微生物組裝配模式、研究根部微生物組對不同環境條件下植物適應性的影響、研究微生物與微生物之間的相互作用、以及微生物基因功能提供了新的機會[44-46]（圖2f）。

在無菌條件下使用SynComs可為研究人員提供可控的生態環境，其中可嚴格控制微生物、養分和植物基因型，產生可重複的結果，可用於對觀察到自然土壤中根部微生物組模式進行驗證。例如，與自然土壤或含有38個細菌菌株的煅燒粘土重組系統中生長的野生型植物相比，Lebeis及其同事檢測到水楊酸信號突變體的擬南芥根微生物組發生了變化[43••]。SynCom實驗中顯示野生型和突變型植物豐度不同的七個細菌菌株中，有四個屬於自然土壤中野生型和突變型植物豐度差異的科。因此，基於從自然土壤和實驗室合成群落條件下獲得的證據，作者得出結論：水楊酸介導的植物先天免疫信號通路在科水平上調節擬南芥根微生物組的組裝[43••]。Castrillo及其同事採用了類似的邏輯，他們研究了磷酸鹽飢餓途徑對擬南芥根微生物組建立的影響[40••，41]。這些作者確定了天然土壤和使用木村培養基(Murashige & Skoog)瓊脂平板進行的SynCom實驗中，均表現為野生型植物和幾種磷酸鹽飢餓突變體之間差異的根部微生物組組成。

此外，SynCom利用測序培養細菌的方法提供了簡單且可重現的系統，用於研究根代謝物（例如三萜，芳香酸，香豆素和camalexin）在複雜自然土壤中對根微生物組與宿主植物之間相互作用的作用[ 47••-49•-51]。總之，在受控條件下使用SynComs進行的實驗可以驗證根微生物組的裝配模式，並補充了在自然土壤條件下根微生物組的研究。

用SynCom在無菌系統中接種無菌植物的主要好處是能夠研究不同環境條件下根部微生物組的功能。例如，Duran及其同事在基於土壤的FlowPot系統中用不同的SynCom（包括細菌，真菌和卵菌）接種了無菌的擬南芥植物，並發現根細菌微生物組在天然土壤中保護擬南芥植物免受絲狀真核生物（真菌和卵菌）的侵害[7••]。Castrillo及其同事在低磷酸鹽條件下用SynComs接種了無菌植物，結果表明細菌接種顯著增加了植物的磷酸鹽飢餓反應，而磷酸鹽飢餓途徑的主要調控因子直接抑制了植物的先天免疫系統[40••]。此外，有研究表明少量的SynComs的特徵足以預測微生物組在擬南芥對磷酸鹽利用中的影響[41]。最近的一項後續研究表明，伯克霍爾德氏菌與植物競爭磷酸鹽的利用，加劇了植物磷酸鹽的飢餓[42]。張婧贏及其同事利用從秈稻和粳稻品種的微生物組中培養出來的細菌，發現水稻根系微生物組促進了植物對有機氮的利用[8••]，詳見《NBT封面：水稻NRT1.1B基因調控根系微生物組參與氮利用》。基於對野生抗病和易感番茄品種根系微生物群的相關性分析，Kwak及其同事成功地培育了一種目標黃桿菌，並證明了將其接種到番茄根中後能增強抗枯萎病能力[10••]，詳見《NBT：根際微生物組抗番茄枯萎病 和 PPT思路梳理》。培養的假單胞菌進行基因組分析，鑑定了脂肽的生物合成和群體感應是致病性和共生根細菌之間的主要基因組差異[46]，以及根際細菌逃避植物防禦或誘導植物易感性所需的基因[44]。，45]。這些實例證明了SynComs或培養的微生物在闡明根微生物組在不同環境條件下對植物適應性的影響等方面的實用性。

培養的微生物和SynCom方法為探索微生物與微生物之間的相互作用和微生物基因功能提供了獨特的機會。牛犇及其同事使用瓊脂系統和由從玉米根部培養的七個細菌菌株組成的SynCom，顯示出洩殖腔腸桿菌(Enterobacter cloacae)的去除導致玉米幼苗根部微生物群落結構的完全喪失，證明了微生物－微生物相互作用的重要性和微生物組中關鍵物種的存在[52]，詳見《PNAS：人工構建玉米極簡微生物組》。Duran及其同事對培養的根源細菌，真菌和卵菌進行了大規模的二元互作分析，發現細菌對絲狀真核生物的生物防治活性是冗餘的性狀，可以維持根微生物組的相互平衡[7••]，詳見《Cell ：根部微生物跨界的互作促進擬南芥生存》 。Levy及其同事發現，與Acidovorax的delta-Hyde1和VI型分泌系統（T6SS）突變體相比，野生型Acidovorax與大腸桿菌和6種細菌分離株共培養的存活率降低了10²-10⁶倍，表明Hyde和T6SS介導的抗菌活性可用於調控微生物組[21••]，詳見《NG：微生物是如何適應植物的？評論文章 正文解讀》。這些研究揭示了培養的微生物在剖析微生物與微生物相互作用中的價值。

結論

Conclusions

由於土壤環境的複雜性，當前的SynCom方法只能部分模擬自然條件。SynCom系統的低複雜性可能意味著缺少一些重要的微生物組成員或營養物質。然而，在進行微生物培養後使用SynComs在無菌系統中進行實驗，這使我們能夠闡明根系微生物組與植物表型之間的因果關係，並剖析微生物組成員在自然土壤條件下的相互作用。為了進一步揭示根部微生物組在植物生長和健康中的功能和機制，需要更多的培養微生物、基因組測序、改進的無菌苗種植系統以及對不同功能微生物組成員的系統研究。

參考文獻

略，詳見原文，而且有重點推薦和總結導讀

附. Current Opinion in Microbiology植物微生物組專題列表

1. 根系微生物組與乾旱 Causes and consequences of a conserved bacterial root microbiome response to drought stress(Devin Coleman-Derr)

2. 微生物組與植物免疫 Beyond pathogens: microbiota interactions with the plant immune system(Jeffery L Dangl)

3. 真菌組與植物和細菌 The mycobiota: fungi take their place between plants and bacteria(Luisa Lanfranco)

4. 微生物組防控寄生雜草 Harnessing the microbiome to control plant parasitic weeds(Francisco Dini-Andreote)

5. 植物與微生物組的進化 Tracing the evolutionary routes of plant–microbiota interactions(Davide Bulgarelli)

6. 葉際微生物組 A brief from the leaf: latest research to inform our understanding of the phyllosphere microbiome(Johan HJ Leveau)

7. 植物核心微生物組 Abundance-occupancy distributions to prioritize plant core microbiome membership(Ashley Shade)

8. 微生物組與作物產量 Next generation microbiome applications for crop production — limitations and the need of knowledge-based solutions(Angela Sessitsch)

9. 細菌-真菌平衡與動植物健康 Contribution of bacterial-fungal balance to plant and animal health(Stéphane Hacquard)

10. 根系分泌物 Crying out for help with root exudates: adaptive mechanisms by which stressed plants assemble health-promoting soil microbiomes(Jurriaan Ton)

11. 氮獲得 Microbial associations enabling nitrogen acquisition in plants (Radutoiu,Simona)

12. 氮平衡與真菌 The role of nutrient balance in shaping plant root-fungal interactions: facts and speculation(Marcel Bucher)

13. 細菌分離、合成群落和無菌體系還原法 Reductionist synthetic community approaches in root microbiome research (Yang Bai)

統計截止19年11月14日，文章列表仍在更新中，詳見

https://www.sciencedirect.com/journal/current-opinion-in-microbiology/vol/49/suppl/C

作者簡介

白洋

白洋，博士，研究員，博士生導師

2005年畢業於武漢大學，2007年獲得武漢大學植物發育生物學碩士學位，2010年在德國科隆大學獲得植物發育生物學博士學位，2011—2015年博士後期間在德國馬克斯普朗克植物育種研究所進行植物根系微生物組學的研究。2016年至今，任中科院遺傳與發育生物學所研究員，也是中國科學院-英國約翰英納斯中心植物和微生物科學聯合研究中心(CEPAMS)首位研究員目前主要研究根系微生物組在植物抗病抗逆、營養高效等過程中的功能。在Nature、Science、Nature Biotechnology、ISME J、GigaScience、Science China Life Sciences等雜誌發表論文30餘篇。

劉永鑫

劉永鑫，博士。2008年畢業於東北農大微生物學，2014年於中科院遺傳發育所獲生物信息學博士，2016年博士後出站留所任工程師。目前主要研究方向有微生物組數據分析與解讀、分析方法開發與優化和科學傳播。目前以第一作者(含共同)或微生物組數據分析負責人在Science、Nature Biotechnology、Cell Host & Microbe等雜誌發表論文20餘篇，引用千餘次。微生物組分析平臺QIIME 2項目參與人。受邀以第一作者和/或通訊作者(含共同)在Protein & Cell、Current Opinion in Microbiology、遺傳等雜誌發表微生物組研究方法綜述。2017年7月創辦「宏基因組」公眾號，目前分享本領域相關原創文章2000餘篇，代表作品有《微生物組數據分析與可視化》、《QIIME2中文教程》等，關注人數9萬+，累計閱讀1600萬+。

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