微生物 18S rRNA區域和引物的選擇對研究真菌多樣性的影響

2021-01-16 諾禾科服

核糖體RNA基因（rDNA）擴增子的高通量測序技術的發展，成為大規模的研究微生物群落多樣性和結構很有利的方法。目前，高通量測序技術對讀長有嚴格的要求，並且讀長都比較短，因此擴增子的區域選擇成為研究群落結構很關鍵的因素。目前，已經有很多報導針對細菌16S rDNA區域和引物的選擇進行研究，但真菌18S rDNA的卻很少。本研究基於該思路，研究了18S rDNA區域和引物的選擇對研究真菌群落多樣性的影響。


本研究首先使用SILVA database篩選出真核生物的序列，分析了31,862 條18S rDNA序列，並使用DegePrime軟體進行引物設計。之後使用計算機模擬PCR擴增反應，並使用MiSeq和454兩種測序平臺的策略，對引物的擴增效果以及物種注釋情況進行評估。結果表明，引物574*F-1132R擴增得到的V4-V5區域最有利於真菌多樣性的研究。


圖1 不同區域產物在不同分類水平上的注釋結果（綠色：注釋到中的；黃色：注釋到屬的；橙色：注釋到屬以下；紅色：注釋不到結果的）


為了進一步的驗證上述的結果，本研究還進行了樣品的實際分析，選取了海水、土壤、廢水底泥、人糞便、酵母（陽新對照）、大腸桿菌（陰性對照）不同類型的樣本，利用574*F-1132R引物進行18S rDNA V4-V5的擴增，MiSeq測序平臺進行測序。分析結果證明上述研究發方法可以反應不同樣本中的真菌群落多樣性和結果特徵。


圖2 不同環境樣本中的真菌物種分類情況


參考文獻

Luisa W. Hugerth,Emilie E.L. Muller, et al. Systematic Design of 18S rRNA Gene Primers for Determining Eukaryotic Diversity in Microbial Consortia[J]. PLOS ONE, 2014.



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