文獻解讀|瘤胃微生物的抗生素抗性基因鑑定

Characterization of antibiotic resistance genes in the species of the rumen microbiota

瘤胃微生物的抗生素抗性基因鑑定

作者：Yasmin Neves Vieira Sabino, Mateus Ferreira Santana, Linda Boniface Oyama等

期刊：Nature Communication

時間：2019.11.20

IF：12.35

一、研究背景

多種藥物耐受的細菌的感染給臨床和畜牧治療帶來了很大挑戰，人們對反芻動物胃腸道細菌的抗生素抗性基因 (Antibiotic-Resistance Genes, ARGs)流行情況還不甚了解。本文對435個反芻動物的微生物基因組進行了研究，並對代表性抗性表型進行了體外驗證。發現大量微生物基因組存在四環素抗性基因且其中的tet（W）處於正選擇壓力之下。在幾個細菌基因組中tet（W）位於新整合性結合元件（Integrative and Conjugative Elements, ICE）之上。此外，本研究還使用宏轉錄組數據分析了活躍轉錄的抗性基因。總之，我們對反芻動物瘤胃的關鍵微生物進行了抗生素抗性研究，揭示可移動遺傳元件対瘤胃微生物耐藥方面起到的潛在功能，為人類和動物的健康提供了應用依據。

二、實驗設計

1. 基因組數據的選擇和ARGs的鑑定及統計分析

從Hungate1000項目選擇435個瘤胃動物微生物的基因組序列（425個細菌和10個古菌），用3種軟體（ARG-ANNOT、ResFinder和Resfams）尋找抗生素抗性基因並進行分類。

對下載的微生物16S rRNA數據進行進化分析，以探究ARGs與微生物的進化關係；確定高頻率出現的ARGs在基因組中的位置，評估其保守性。

2. ARGs的遺傳內容及ICEs保守性

為了研究ARGs的可轉移機制，我們對約4000bp、包含抗性基因的scaffold進行分析，預測其上的蛋白遺傳元件及其功能並尋找整合性結合元件及其攜帶的ARGs。同時對這些 ICEs進行聚類分析以評估其遺傳保守性。使用PCR法檢測一個在Blautia schinkii中預測到的新ICE是否真實存在。

3. ARGs的選擇壓力和抗性表型的體外驗證

預測ARGs中發生錯義突變和無義突變的位點數量，以評估ARGs的選擇壓力。對26個含有ARGs的瘤胃微生物進一步進行體外驗證，即培養這些微生物並用E-test試條測試其耐受的抗生素及濃度。

4. 宏轉錄組分析

下載15份牛和羊的代表性宏轉錄組數據，驗證高豐度ARGs的表達量。

三、實驗結果

1. 瘤胃微生物中的ARGs檢測

使用3個分析軟體對瘤胃微生物基因組中ARGs的數量和分類進行統計。ResFinder從72個基因組中找到11類、141個ARGs，ARG-ANNOT從93個基因組中找到10類、754個ARGs，而Resfams則在430個基因組中發現了9類ARGs的3148 條序列（表1）。豐度最高的ARGs為β-內醯胺類、糖肽類、四環素類和氨基糖苷類，它們集中出現在厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和放線菌門基因組中（表1）。

表1 瘤胃微生物ARGs的預測

2. ARGs的進化分布

ARGs在瘤胃微生物中普遍存在（圖1），一些特殊ARGs則傾向於出現在某些特定的細菌中。例如，很多變形菌門微生物有ARGs，其中的腸桿菌科均可以檢測到ARGs，擬桿菌門及放線菌門的ARGs分別集中在擬桿菌屬和雙歧桿菌屬中。而一些細菌門則沒有檢測到ARGs，也可能是這些門的物種豐度很低。

圖1 抗性基因在瘤胃微生物的分布

根據16S rRNA將瘤胃微生物進行聚類並展示ARGs分布情況（圖2）。69.2%的基因組都含抗性基因，其中擁有tet（包括tet（W）、tet（Q）、tet（O））抗性的基因組最多。進化分析結果顯示，tet（W）在28個基因組中的序列相似性達94.9%以上，序列覆蓋度達99%。

ARGs在物種中的分布差異較大。例如，喹諾酮類抗性基因只存在於表皮葡萄球菌和檸檬酸桿菌NLAE-zl-C269中，甲硝唑和磷黴素抗性基因只分別存在於普氏菌屬及2個表皮葡萄球菌菌株中（圖2），而β-內醯胺抗性基因集中在腸桿菌科、擬桿菌屬及其他2個進化分支中。值得注意的是，大腸桿菌PA-3的ARGs高達5個。

圖2 ARGs在瘤胃微生物中的分布

3.ARGs的遺傳內容

我們研究了tet（W）的遺傳位點及其側翼區域，以評估tet的可轉移潛力。ResFinder在28個基因組中找到了18條包含tet（W）的scaffold，這些長4000bp左右的序列中都有甲基轉移酶編碼基因，且臨近或直接位於tet（W）上遊或下遊。這28個基因組中有7個在臨近tet（W）的地方有Maff-2蛋白編碼基因，該基因與tet抗性有關。10個基因組存在轉座子蛋白編碼基因，22個基因組有細菌接合相關編碼基因。此外，噬菌體蛋白編碼基因也出現在了10個基因組中。

至少有7個基因組存在功能完整的ICEs。以Blautia schinkii DSM 10518的ICE為例，該ICE有多種可轉移遺傳元件及相關基因，包括接合蛋白、分泌蛋白、重組酶等多種相關編碼基因（圖3a）。PCR法證明了新ICE（命名為ICE_RbtetW_07）的存在，進一步驗證了瘤胃微生物發揮四環素抗性是由ICE上的保守元件介導的假設（圖3b）。

圖3 ICE_RbtetW_07的結構和保守性

4. 四環素抗性基因選擇壓力分析

用密碼子置換率（dN/dS值）來表徵四環素抗性基因的進化情況。Tet（W）蛋白的639個胺基酸殘基中有36個的dN/dS值＞1，說明主要分布於3個位點的這36個胺基酸存在正選擇壓力（圖4a）。而Tet（Q）和Tet（O）分別有25個和17個胺基酸可能存在正選擇壓力（圖4bc），但dN/dS值＜1，加上似然比檢測結果也不顯著，說明這2個基因不存在選擇壓力。

圖4 四環素抗性基因選擇壓力分析

5. 抗生素表型測試

挑選26種純培養菌（含57種抗性基因）進行抗生素抗性體外驗證，結果顯示其中的18個具有抗性。ARG-ANNOT、ResFinder和Resfams軟體預測的準確率分別是71.4%、64.3%和32.1%，前兩個軟體的預測結果與體外驗證結果更接近。

3種方法都能檢測到tet基因存在的微生物佔69%，證明了該基因的普遍性。某些抗性基因即使只被一種生信工具預測到，它們也能賦予微生物相應的抗生素抗性，如存在於梭菌屬、Lachnoclostridium和瘤胃乳酸菌DSM 2040的萬古黴素抗性基因，存在於偽長雙歧桿菌DSM 20092的氨基糖苷抗性基因，等等（圖5）。

圖5 抗生素抗性預測及體外驗證的一致性

6. ARGs的表達量

牛和羊瘤胃微生物轉錄組的15份樣品中都能檢測到ARG（圖6），豐度排在前五位的分別為氨基糖苷類、醯胺類、大環內酯類、四環素類和萬古黴素類，其中四環素類的表達量最高。在不同的樣本中ARGs表達量有所差異，有些整合在微生物基因中的ARGs（如strA、cepA、ermB等）在所有樣本中均未檢測到表達（圖6）。

圖6 ARGs的表達水平（RPKM）

四、小結與亮點

本研究預測了435個瘤胃微生物基因組中抗生素抗性基因及其分布情況，結果顯示β-內醯胺類、糖肽類、四環素類和氨基糖苷類抗性基因是最豐富的ARGs，它們集中出現在厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和放線菌門基因組中。tet（W）序列保守，其側翼序列結構顯示該抗性基因可以通過ICE在微生物間水平傳播。體外驗證與抗性預測結果大體一致，而tet抗性基因的高表達和一些抗性基因的低表達也與體外驗證結果相符。總之，該項目對瘤胃微生物的抗生素抗性特徵進行了研究，為進一步探索瘤胃微生物ARGs提供了依據。

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