科學家成功對環境微生物群落進行CRISPR基因編輯

2020-12-05 中國生物技術網

引入基因突變，然後觀察表型的變化，是微生物基因功能研究的常用手段。但是，這種方法通常是針對可分離培養的單個物種。對於那些無法在實驗室培養的微生物，我們對它們的了解非常有限【1】。另外，分離培養的方法無法研究不同物種間的相互作用【2】。最後，分離培養的微生物會對實驗室環境產生適應，不能完全反映其在自然界中的真實情況【3】。微生物群落對人類健康、環境保護和工業發展等有十分重要的作用，能夠在微生物群落中進行精準基因編輯的方法將會大大促進我們對微生物的認識。

近日，加州大學CRISPR研究大牛Jennifer Doudna課題組在預印本伺服器bioRxiv上傳了題為Targeted Genome Editing of Bacteria Within Microbial Communities的論文。研究人員開發出了新的技術，可以對任何複雜微生物群落中的特定物種在原位進行位點特異性的CRISPR基因編輯，而不需要預先的分離培養。

對微生物群落進行基因編輯之前，首先要知道哪些物種是可以有效地攝取並且整合外源核酸物質的。實驗人員開發了新的方法Environmental Transformation Sequencing(ET-Seq)來從微生物群落中鑑定出哪些細菌可以被有效地基因編輯（圖1）。通過ET-Seq的方法，研究者還找到了最合適的DNA遞送方式，以用於下一步的CRISPR基因編輯。值得注意的是，作者還鑑定出10個未能在實驗室分離培養的物種。ET-Seq的結果提示，它們也可被基因編輯。

接下來，作者使用CRISPR-Cas Tn17轉座酶系統對微生物群落進行基因編輯（詳情請見BioArt報導：Science+Nature：當CRISPR遇上轉座子，位點特異性高效插入）【4-8】。傳統的CRISPR-Cas轉座酶系統需要兩個或以上的質粒，而這項研究中實驗者對體系進行了優化，開發了DNA-editing All-in-one RNA-guided CRISPR-Cas Transposase(DART)系統。作為驗證，實驗人員成功對微生物群落中的兩種特定的細菌進行了基因編輯。對環境微生物的分離培養、轉化和基因編輯通常需要上年的時間，而且很容易失敗。這裡提出的原位微生物遺傳學策略只需要幾周的時間，且不需要分離培養。

圖1. ET-Seq的流程

將來我們可能需要更有效的工具，以進行可廣泛應用的、持續時間長的基因打靶。傳統的抗生素抗性篩選的辦法可能不適用於微生物群落中的基因編輯，因為複雜的群落中可能存在天然的抗性。要想提高基因編輯的效率，我們還需要更有效的核酸遞送系統，和進一步優化的正向和反向篩選策略。

原文連結：

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.07.17.209189v1.full.pdf

作者：BioartReports

參考文獻：

1. Steen, A. D. et al. High proportions of bacteria and archaea across most biomes remain uncultured.ISME J. (2019) doi:10.1038/s41396-019-0484-y.

2. Pascual-García, A., Bonhoeffer, S. & Bell, T. Metabolically cohesive microbial consortia and ecosystem functioning. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 375, 20190245 (2020).

3. Fux, C. A., Shirtliff, M., Stoodley, P. & Costerton, J. W. Can laboratory reference strains mirror 『real-world』 pathogenesis? Trends Microbiol. 13, 58–63 (2005).

4. Strecker, J. et al. RNA-guided DNA insertion with CRISPR-associated transposases. Science 365, 48–53 (2019).

5. Klompe, S. E., Vo, P. L. H., Halpin-Healy, T. S. & Sternberg, S. H. Transposon-encoded CRISPR–Cas systems direct RNA-guided DNA integration. Nature571, 219–225 (2019).

6. Petassi, M. T., Hsieh, S.-C. & Peters, J. E. Guide RNA categorization enables target site choice in Tn7-CRISPR-Cas transposons. bioRxiv 2020.07.02.184150 (2020) doi:10.1101/2020.07.02.184150.

7. Rice, P. A., Craig, N. L. & Dyda, F. Comment on 『RNA-guided DNA insertion with CRISPR-associated transposases』. Science368, (2020).

8. Strecker, J., Ladha, A., Makarova, K. S., Koonin, E. V. & Zhang, F. Response to Comment on 『RNA-guided DNA insertion with CRISPR-associated transposases』. Science368, (2020).

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