促進腸球菌獨特生物學和內在抗生素耐藥性的基因

2020-12-21 中國生物技術網

編輯：李欣雨 佘尼卓嘎 王嘉瑩 魏韜（華南農業大學食品學院）

腸球菌是耐多藥醫院感染的主要原因之一，以其對環境的堅固性而著稱，並延伸至固有的抗生素抗性。為了鑑定賦予這種獨特屬性的基因，Michael團隊使用 Tn-seq 技術全面探索糞便腸球菌菌株MMH594的基因組，尋找對於在含營養的培養基中生長且具有低水平抗生素攻擊作用的重要基因。正如預期的那樣，與其他細菌共享的用於DNA複製，表達和中樞代謝的基因的大核心不耐受轉座子破壞。然而，基因鑑定對於糞腸球菌來說是很重要的，經過類似的測試可知，它們對於金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌的適應性是沒有影響或不重要的。此外，已鑑定出217個基因，當受到亞MIC抗生素水平的挑戰時，它們表現出對轉座子破壞的耐受性降低，包括那些先前被證明有助於內在抗性的基因，以及其他先前未賦予這種作用的基因。E. 糞便是少數在實驗實驗中證明具有功能性Entner-Doudoroff碳代謝途徑的革蘭氏陽性細菌之一，這種途徑有助於其他微生物的抗應力。通過功能基因組學和網絡分析，Michael團隊在糞腸球菌中定義了該途徑的異常結構並評估了其重要性。這些方法還確定了毒素-抗毒素和相關系統。最後，Michael團隊鑑定了在最接近的非腸球菌親戚vagococci中不存在的基因，這些基因在選擇和不選擇抗生素的情況下對適應性都有重要貢獻，從而增進了對腸球菌獨特生物學的理解。

腸球菌是醫院傳播的抗生素耐藥性感染的主要原因。這些生物固有的抗性使它們能夠在消毒操作中倖存下來，然後在經過抗生素治療的患者的胃腸道中增殖。這項研究的目的是確定其異常堅固的潛在遺傳基礎。通過使用功能基因組學方法，Michael團隊確定了腸球菌生存和生長具有普遍意義的特徵和途徑，從而將它們與密切相關的病原體以及其原始物種區分開來。我們進一步確定了使他們能夠在抗生素挑戰中生存的獨特特徵，揭示了一大組有助於內在抗生素抗性的基因，以及一小組在腸球菌以外罕見的獨特重要基因。

Michael團隊構建了高複雜水手轉座子插入庫糞腸球菌MMH594，多重耐藥性菌株引起的持續時間超過3年。在探索糞腸球菌所依賴的基因的作用和貢獻之前，Michael團隊首先評估了該文庫的完整性。為了確保儘可能強大的數據集和測試重現性，水手的10種不同培養物將轉座子插入庫獨立接種，並在營養豐富的Mueller-Hinton肉湯中不同天培養12代。從每個轉座子接頭的序列讀取數可以推斷出種群中各種轉座子插入的相對豐度。Michael團隊使用最初用於金黃色葡萄球菌的轉座子插入測序（Tn-seq）研究的程序，並通過改進分析流程進行完善，將插入圖譜映射到封閉的糞腸球菌MMH594基因組中的基因。最近從一個自1985年以來一直沒有傳代存檔的種群中確定了該菌株的一個新的封閉基因組序列。該分析確定了38，366個不同地點的水手插入物，並在培養物之間產生了高度可重複的結果。觀察到插入偏置的進一步來源，它源於細菌染色體複製的性質。

有了幾乎所有結構基因的多次插入證據，這些結構基因將耐受轉座子插入破壞並仍然產生能夠生長和分裂的細胞，Michael團隊接下來尋求鑑定那些編碼對糞腸球菌適應性有獨特貢獻的功能的基因。為了標準化插入的數目並將插入連接的讀數標準化為基因大小，Michael團隊計算了先前使用的D值（dVal）指標的變體。此外，排除了閱讀框的前10％和後10％的插入，Michael團隊對每個基因的中央80％內發生的插入進行評分。從dVal推論，突變群體中MMH594基因突變的相對豐度如圖1所示。

圖1

從基於低 dVal 的候選資格晉升到"關鍵"或"重要"分類還需要額外的驗證。首先，Michael團隊使用嚴格的統計排列檢驗來評估轉座子插入相對於當地基因組環境而言耗竭的基因。然而，這僅在染色體四分位中以複製末端為中心的染色體中發現了36個插入缺失基因，佔四分位數以複製起點為中心的頻率的33％，而前者的基因平均高出29％，這表明觀察到的複製偏差和其他可能原因導致的假陰性率很高。為了說明局部環境因複製偏倚和必要的基因聚類而產生的歪斜，Michael團隊對總體上具有低dVal的鄰近基因進行了第二次統計評估。這在末端四分位數中鑑定出另外56個基因，但對於驗證不耐受破壞的基因仍然顯示出有限的敏感性。為了確定其他可能的假陰性，Michael團隊採用第三種方法，將Tn-seq結果與兩種相關的低G + C革蘭氏陽性病原體的研究進行了比較，肺炎鏈球菌和金黃色葡萄球菌。在那些研究中，具有高度保守直向同源物的基因被歸類為必需或可能必需，然後考慮外部驗證。通過這種多層正交方法，至少一個附加標準驗證的349個基因被歸類為「 Fitness Critical」，而224個基因被相似地歸類為「 Fitness Important」。

圖二

結構功能分析表明，HEPN家族蛋白的二聚體具有針對mRNA的RNase活性，實際毒素 HEPN 家族蛋白和抗毒素核苷醯轉移酶形成八位體。這再次證明了 Tn-seq 分析的穩健性，用於識別與負選擇相關的特徵。

關於糞腸球菌對頭孢菌素、其他β-乳酸、循環肽和達普託黴素的內在耐藥性的幾乎所有已知結果，Tn-seq為揭示基因與該物種的內在耐藥性提供了一個強大的工具。除了支持已知關係外，Tn-seq 分析的內部高度競爭性質還提供了有關構建各種類型突變體相關的相對懲罰的額外見解，識別了那些第二位抑制器可能輕易超過突變體群體的突變體。除了確定對腸球菌具有獨特重要性的功能外，Michael團隊還揭示了一個長期存在的謎團，即腸球菌和可能相關的生物體如何能夠在沒有ED酶的情況下通過 Entner-Doudoroff 分流器代謝葡萄糖酸鹽。最後，將許多假想的蛋白質編碼基因與表型關聯，為功能提供洞察，並為試圖從基因上定義腸球菌的獨特性質建立優先級的基礎。儘管許多已鑑定的基因已經通過文獻中的直接實驗得到驗證，實驗也盡最大努力補充方法，從生成的數據中提取新的見解，從而限制和平衡假陽性與假陰性，但許多被鑑定的基因的作用和重要性仍有待檢查。

論文連結：

https://mbio.asm.org/content/11/6/e02962-20#sec-1

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