在各類微生物群落研究文章中，堆疊圖可以說是一個圖形「常青樹」，頻繁出現在文章結果展示部分的開頭位置。堆疊圖之所以能在文章中擁有這麼高的曝光度，原因在於堆疊圖非常直觀、簡潔地展示樣本的群落物種組成組成信息。通常堆疊圖橫軸為各樣本名稱信息，縱軸為物種的相對豐度，每個樣本所有物種組成一個堆疊起來的柱子，柱子中通過顏色區分不同物種（如圖1）。例如在梯度處理或是不同時期的樣本展示中，我們就可以通過堆疊圖一目了然地展示優勢物種的變化情況或是某些病原微生物隨時間的豐度增長狀況。
事實上，堆疊圖在微生物群落研究中不僅出現於上文提到的物種組成分析中，還出現於β多樣性以及群落功能分析中。在形態上，也不僅是柱狀堆疊的形式，有時它也會以面積堆疊的形式出現。堆疊圖的坐標軸也並非固定不變的100%，有時也能以特定範圍進行呈現。
提到群落研究中的堆疊圖，大家總是能想到它在物種組成分析中的應用。事實上，堆疊圖還能夠與β多樣性分析的UPGMA聚類樹進行結合，基於不同的樣本距離矩陣（如bray-curtis、unifrac等類型距離） 進行相似性聚類，將組成結構相似的樣本聚類到同一個小的分支，將結構組成差異大的樣本聚類到不同的分支中。在聚類樹的基礎上，結合堆疊圖，用堆疊圖具體展示相對豐度相近與相異的物種。這類型組合圖提高了信息密度，用一張圖展示了樣本相似性關係與樣本物種組成，在應用範圍上得到了拓展，如在不同處理下觀察處理效果對於群落結構的整體影響以及對個別關注物種的影響情況，就需要這類型的組合圖進行展示。
除了結合聚類樹用於展示各樣本不同分類水平下的物種的組成外，堆疊圖還可以用於展示樣本微生物群落的功能組成信息。群落功能預測近年來興起，功能堆疊圖也在文章中頻頻出現。主要有兩方面原因：1）宏基因組開始普及使用，16s+宏基因組是目前一種互相驗證、互相補充的可靠組學貫穿策略。通過16s的大樣本篩選出目標差異樣本，再針對目標樣本進行宏基因組測序，找到關鍵差異基因進行功能富集分析。群落功能預測就是兩者連接的一個橋梁，群落功能預測可以幫助我們初步判斷樣本間潛在差異的功能，縮小宏基因組的研究範圍。2）功能預測軟體不斷迭代，預測準確性與過往相比有了非常高的提升。（可參考文章：《picrust2——更強大的菌群功能預測工具》）功能堆疊圖與物種組成堆疊圖類似，展示樣本內各功能的豐度佔比情況，可以通過堆疊圖掌握樣本總體的功能組成，優勢功能類型以及各樣本主要功能的差異情況。至於後續需要量化分析樣本間具體功能的差異就需要藉助熱圖以及統計檢驗等手段進行深入地功能挖掘。
堆疊圖是一種有著一定擴展能力的圖形，不局限於簡單的柱狀堆疊的形式，可以結合統計檢驗的結果，標註出樣本間存在統計學顯著性差異的物種信息。這種圖形比較適合用於目標物種是堆疊圖中的優勢物種，在較高分類層級（門、綱等）進行比較。
當需要展示的樣本比較多且樣本間的處理存在連續關係時（如藥物處理後不同時間段腸道樣本、不同濃度梯度肥料處理的土壤樣本），由於樣本量較大，以傳統柱狀堆疊圖的形式進行展示不直觀，樣本物種組成凌亂。這時可以考慮採用堆疊面積圖的形式進行展示，將原先樣本間獨立的樣本物種組成模擬成連續的變化曲線，幫助我們更直觀地觀察連續變化下樣本的物種豐度變化趨勢。
1.堆疊圖是一種用於展示樣本群落結構、功能結構的基礎圖形。
2.堆疊圖可結合基因β多樣性距離矩陣的UPGMA聚類樹展示樣本相似性，也可以結合統計檢驗結果展示組間/樣本間存在顯著差異的物種。
3.針對存在連續性變化（時間變化、梯度處理變化）的大樣本量展示時，可採用面積堆疊的方式展示連續變化對群落物種的影響情況。堆疊圖的繪製方法很多，但能夠將微生物群落測序數據完整分析的工具卻很少。基迪奧omicsmart在線分析雲平臺，上傳測序下機的原始數據即可完成一整套包括物種組成、多樣性、功能預測等幾十項分析點的標準流程分析，可根據個人需求隨時調整圖形配色、字體、形狀等各類型參數。
可自由調整各類參數，根據輸入物種豐度排名進行堆疊圖展示。[1] Lv H, Pian R, Xing Y, et al. Effects of citric acid on fermentation characteristics and bacterial diversity of Amomum villosum silage. Bioresour Technol. 2020;307:123290.[2] Meeker SM, Mears KS, Sangwan N, et al. CFTR dysregulation drives active selection of the gut microbiome. PLoS Pathog. 2020;16(1):e1008251. Published 2020 Jan 21. doi:10.1371/journal.ppat.1008251[3] Zhang J, Zhao Y, Ren D, et al. Effect of okra fruit powder supplementation on metabolic syndrome and gut microbiota diversity in high fat diet-induced obese mice.[J]. Food Research International, 2020.[4] Bost A, Martinson V G, Franzenburg S, et al. Functional variation in the gut microbiome of wild Drosophila populations[J]. Molecular Ecology, 2018, 27(13): 2834-2845.[5] Ding N, Zhang X, Zhang X D, et al. Impairment of spermatogenesis and sperm motility by the high-fat diet-induced dysbiosis of gut microbes.[J]. Gut, 2020.[6] Zhang J, Zhang N, Liu YX, et al. Root microbiota shift in rice correlates with resident time in the field and developmental stage. Sci China Life Sci. 2018;61(6):613-621. doi:10.1007/s11427-018-9284-4
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