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編譯：jiee，編輯：小菌菌、江舜堯。
原創微文，歡迎轉發轉載。
導讀空氣作為一個適合微生物生存的生態系統，但還未被充分研究。本論文描述了熱帶地區空氣微生物介導的精確的晝夜循環。作者在本文中採集了795個來自熱帶空氣的不同時間的樣品，進行宏基因組測序，產生了2.27 TB數據。宏基因組分析結果表明：真菌、細菌和植物在近地表大氣中的存在都遵循特定的時序。儘管只有9 - 17%的序列可以注釋到物種，但空氣中存在的微生物多樣性足以與地球上其他生態系統的複雜性相匹敵。空氣中的微生物遵循一個明顯的精確的循環，環境參數是主要的驅動因素，且其中溫度是最重要的因素。一天內分類學多樣性的變化大於不同天之間和不同月之間的變化。不同時間序列的環境樣品揭示了空氣微生物群落中存在一個保持13個月不變的核心微生物類群，暗示其具有長期穩健性。與原核生物普遍存在的陸地或水生環境不同，熱帶空氣中的生物量主要由真核生物的DNA組成。特定的真菌和細菌類群與溫度、溼度和二氧化碳濃度密切相關，使它們成為研究大氣生物氣溶膠動力學的合適的生物標誌物。
原名：Microbial communities in the tropical air ecosystem follow a precise diel cycle
譯名：熱帶空氣生態系統中的微生物群落遵循一個精確的循環
期刊：PNAS
IF：9.58
發表時間：2019.11.12
通訊作者：StephanC. Schuster
1.熱帶空氣的微生物多樣性
作者首先評估了DVE1中的一個隨機空氣樣本(DVE1011)的物種多樣性，並和採自新加坡同一地理區域的海水、土壤和人體腸道微生物樣本(每個樣本都標準化到200萬條reads)進行比較。空氣樣本中可注釋微生物的比例最低(9 - 17%，夜間/白天)，而研究最為深入的人類微生物組在界水平上有高達64%可被注釋(圖1A)。空氣微生物組中無法注釋的reads部分包括：35%匹配到未知物種和48%與資料庫不匹配。不匹配的序列可能有以下來源：
1)真核生物的基因間區；
2)暴露於惡劣環境條件下而產生變異的胞外DNA；
3)尚未發現的微生物，目前在資料庫中沒有代表序列。
因此，與土壤和海水相比，空氣是目前全球範圍內研究最少的生態系統。
儘管可注釋的reads佔比較低，但空氣樣本的物種豐富度與其他3個生態系統相當(圖1B)。與這些以細菌為主的環境不同的是，熱帶空氣樣本中很大比例的可注釋reads屬於真菌(82%)，只有14.5%屬於細菌，2.6%屬於植物物種，0.087%屬於古菌(圖1C)。得益於測序數據和宏基因組分析可以進行種水平的鑑定，作者使用前40的真菌和細菌的已知的基因組大小(SI附錄,圖S1)對DNA測序read的豐度進行了均一化，從而近似估算細菌和真菌的細胞數量(假設每個細胞只有一條染色體)。細菌和真菌細胞的估計比例分別為62.1和37.9%(圖1D)。對於夜間樣本，可注釋的reads的百分比下降到只有9%，其中大多數細菌的reads不見了(圖1 E和F)。
圖1 微生物群落結構。(A)海洋、空氣、土壤和人類腸道生態系統樣品中微生物在界水平的相對豐度。(B)四個對應生態系統種的物種數目。(C) 5個DVE宏基因組樣品中reads注釋到不同分類單元的的相對豐度。(D)根據基因組大小歸一化reads數目，估計細菌與真菌的細胞比例。(E)日間和夜間空氣樣本中微生物的相對豐度。這兩個樣本是從整個DVE1數據集中隨機選取的。(F)相應的日間及夜間空氣樣本中注釋到的物種數目。
2.時間序列環境樣品的採集
通過對一個3.3億reads的超深度測序數據和一個獨立測序的400萬reads的數據(同一個2小時樣品DVE1011)進行比較，作責確定200萬條隨機取樣reads足以對空氣微生物中500個最豐富的物種進行鑑定和排序(附錄SI，圖S2、S5)。這一觀察結果，加上最低的生物量的要求，確定了DVE2-5這一時間序列環境樣品的採集策略：採樣間隔為2小時，每天採集12個時間點。對DVE1-5分別進行了統計分析。在每個測序樣品中隨機抽取200萬條reads，DVE1數據集中平均有12.16%可被注釋，DVE2中有10.30%，DVE3中有12.46%，DVE4中有11.66%，DVE5中有8.25%，可被注釋的微生物中中大多數屬於細菌或真菌(詳見附錄SI，表S2)。通過對宏基因組學數據的分析，作者在種水平上進行了物種注釋(附錄SI，圖S6，圖S7)。在所有時間序列樣品(DVE1-5)注釋到的微生物中，有725種在整個13個月的採樣期間均可檢測到，因此被認為是空氣菌群中的核心微生物。相比之下，只有74到206個物種只在特定時間序列的樣品中出現(圖2A和SI附錄，表S3)。
圖2 空氣微生物的時序變化。(A)在5個時間序列樣品(DVE1-5)中同時出現物種的維恩圖。（B-D）每個時序樣品中所觀察到的物種數的箱線圖。(B)物種豐富度在一天內分布(2小時採樣間隔)。(C)物種豐富度的日際變化，考慮5天的日平均值，覆蓋DVE2-5數據集。(D)物種豐富度月間變化，取3個月內5天樣品的平均值，共覆蓋13個月(DVE2-5)。離群值顯示為空心圓。
DVE2-5樣品間微生物群落的平均豐富度(通過可注釋物種的數量進行評估)與一天內的微生物變化顯著不同(圖2B和SI附錄，圖S8;RANOSIM=0.62~0.81, PANOSIM <0.001)，然而不同天和不同月之間變化很小（圖2C、D，SI附錄，圖S8;RANOSIM=0.01~0.12, PANOSIM=0.002~0.28）。在24小時內，空氣微生物群落的周期性變化可以被重現，這使採集的空氣樣本可以追溯到採集當天的實際時間。但是，用作者的數據作為參考，想要將樣本匹配到特定的月份/季節很困難。
作者總結了7個空氣微生物類群隨時間的變化來顯示每個類群的變化規律(圖3A)。測序到的植物相關的reads集中注釋在Viridiplantae類群，真菌在Ascomycota和Basidiomycota，細菌在Cyanobacteria、Firmicutes、Proteobacteria、和Actinobacteria。在這些微生物中，植物門和細菌門微生物的相對豐度具有相似的晝夜變化規律(圖3A)，在白天豐度更高，在夜間僅能檢測到很少。相反，擔子菌是唯一一個在夜間豐度高，在白天豐度低的類群(圖3A)。另一方面，子囊菌的豐度在中午或降雨時顯著增加。這些模式在5個DEV數據集中均可以觀察到且具有統計學意義(附錄SI, 表S5;Wilcoxon符號秩檢驗和回歸模型分析)。
在中午當氣溫和太陽輻射達到最大值時，子囊菌的群落豐富度(觀察到的物種數量)增加了4倍，而擔子菌的群落結構在24小時內非常穩定(圖3B)。Viridiplantae的豐富度增加了2-3倍，在中午達到最大值。在上述4個細菌門中，厚壁菌門和變形桿菌群落的豐富度在中午時最大可以增加10倍，而藍藻和放線菌群落在一天的時間內更加穩定，增加了不到5倍(圖3B)。DVE2-5數據集微生物的alpha多樣性值見SI附錄，圖S9。
3.晝夜生物量波動
在時間序列DVE2-5中，以每2小時間隔提取的DNA量近似估計，夜間時段(19:00至07:00)總生物量始終較高(圖4A)。DNA的量在5-500ng(每72立方米樣品)之間變化，導致清晨(05:00)和中午(13:00)之間的差異高達100倍(例如DVE2)。這一晝夜的規律在乾旱季節依然保持,但DNA量下降了30倍，下降到5-150ng(例如DVE3和4)。使用單譜分析後，這種24小時內的波動在連續樣本間的成對Bray-Curtis相似性分析和周期波動規律中都很明顯(圖4B)。
圖3 空氣微生物的晝夜循環。(A)DVE2-5樣品中收集到的總DNA量(ng)的箱線圖。(B)通過單譜分析計算連續樣本之間的配對Bray-Curtis相似性(灰色)和周期波動規律(紅色)。(C和D) DVE2-5中空氣微生物群落結構。(C)兩組樣本中，第一個主坐標軸代表的白天(7:00 - 19:00，橙色圓圈)和第二主坐標軸代表的夜晚(19:00 - 7:00，藍色三角形)的面積。(D)C圖中每個樣品到形心距離的箱形圖。同時顯示PERMDISP2分析的P值。空心圓表示離群值。
圖4 空氣微生物群落的Diel循環。(A)在DVE2至5期間收集的總DNA產量(ng)。(B)連續樣本(灰色)和周期振蕩分量(紅色)Bray-Curtis相似性。(C和D)結構DVE2 ~ 5中空氣傳播的微生物群落。(C)兩組樣本分別代表白天(7:00 - 19:00，橙色圓圈)和夜晚(19:00 - 7:00，藍色三角形)PCoA圖。(D)每組到中心的箱型圖。PERMDISP2的P值如圖所示。未填充的圓表示離群值。
DVE2-5樣品中白天和夜間樣品的DNA量具有顯著差異(Wilcox檢驗，DVE2:P=7.24×10-10；DVE3:P=3.98×10-6；DVE4:P=4.98×10-7；DVE5:P=4.63×10-5)。多變量關聯分析證實，什麼時候採樣對微生物群落的影響大於哪天進行採樣(SI附錄, 表S4)。當假設晝夜對應2種性狀時，特定採樣時間的隸屬度增加。在一天中顯著波動的物種在SI附錄和表S6中列出。微生物群落結構(圖4C和D)在光照時比在黑暗時更分散(DVE2、DVE3和DVE5中群體分散的多變量同質性分析P = 0.001，但在DVE4中不顯著:P = 0.14)。白天比夜間的細菌reads數至少多3倍(SI附錄，表S7)。
為了協調本研究定量比較分析時全基因組測序數據之間的差異，我們還進行了qPCR分析。分別用16S和ITS引物定量細菌和真菌OTUs的絕對豐度。比較分析表明，細菌類群的相對豐度和絕對豐度一致，而由於資料庫和擴增偏差，真菌類群的相對豐度和絕對豐度並不一致(見下文和SI附錄，圖S10)。
4.對環境因子變化的響應
除了晝夜變化外，空氣微生物還對溫度、二氧化碳和降雨等環境因子的變化做出反應(DVE2-5的元數據繪製在SI附錄中的圖S11A)。在新加坡，每日的溫度周期通常是一致的，夜間最低溫度為26攝氏度，白天最高溫度為35攝氏度(SIAppendix, Fig. S11A)。相對溼度從傍晚的50%到後夜時的90%不等。在計算每個時間點的絕對溼度時，還可以觀察到夜間高溼度和白天低溼度的一般模式(SI附錄，圖S11A)。附錄SI，表S8顯示了溫度和相對溼度的相互依賴關係，也稱為飽和水汽壓。近地面大氣中二氧化碳的晝夜循環主要是植物呼吸作用的結果，其變化範圍從夜間的400ppm到白天的460ppm (SI附錄，圖S11A)。DVE3白天的樣品記錄了大風情況下得出的環境參數與其他時間序列測量結果明顯不同(SI附錄，圖S11)。
在所有環境因素中，溫度對空氣微生物群落的影響最大(圖5A)，其次是二氧化碳水平(圖5B)。氣溫升高與細菌類群和子囊菌群豐度升高呈正相關，而真菌種的擔子菌類群呈負相關(圖5C)，且具有很強的統計相關性(Pearson相關性 R > 0.75或<0.75)。特別是在DVE2樣品中，取樣的第2晚和第4天的異常溫度模式可以被幾個微生物的豐度模式很好地反映出來(圖5C)。值得注意的是，所有的細菌門都與溫度的升高呈正相關，而典型的負相關只存在於蘑菇菌綱的擔子菌屬(如：Heterobasidion irregulare, Moniliophthoraroreri, Auricularia delicata, Tulasnella calospora)。這些結果在整個時間序列樣品DVE2-5中都是穩健的(參見SI附錄的表S9)，並得到通過回歸建模獲得的高度顯著相關性的支持(SI附錄的表S10)。
圖5 空氣中真菌和細菌應對環境因素的晝夜變化。(A和B)繪製物種豐富度(觀察到的物種數量或chao1指數)與特定採樣時間點的溫度(A)和二氧化碳(B)的關係圖。紅線為回歸線。橙色和藍色的點分別對應白天和夜晚的時間點。給出了chao1指數與溫度/CO2的Pearson相關指數。(C)溫度。八種微生物的豐度隨溫度的變化而變化。大多數對溫度有正相關的物種是細菌，有9種真菌呈負相關。(D)二氧化碳。兩種真菌對二氧化碳的晝夜變化。兩種環境因素引起的觀測波動高度相關(Pearson相關性 R > 0.75或< 0.75)。
此外，二氧化碳水平與蘑菇菌類的豐度之間具有強相關性，主要以A. delicata(DVE2:R=0.59;DVE3:R=0.59;DVE4:R=0.82;DVE5:R=0.66)和Rhizoctoniasolani(DVE2:R=0.67;DVE3:R=0.59;DVE4:R=0.84;DVE5:R=0.68)為代表(圖5D和SI附錄的表S10)。同樣，在DVE2中，Actinomycetospora chiangmaiensis隨著降雨豐度增加(R = 0.93)，在DVE3中，Diaportheampelina真菌(R=0.80)和Pseudocercosporafijiensis(R=0.88)也隨降雨過程豐度增加。另一種Pezizomycotina真菌：Eutypa lata或者在雨后豐度增加(CCF建模分析:DVE2:R=0.84,t-1;DVE4:R=0.76,t-1;DVE5:R=0.72,t-1)或者在降雨中豐度增加(R=0.81)。另一種Pezizomycotina真菌D. ampelina也觀察到類似的模式(CCF建模分析:DVE2:R=0.94,t-10;DVE3:R=0.78,t-1;DVE4:R=0.82,t-1;DVE5:R=0.53,t-1)(SI附錄圖S12)。
5.建模
應用貝葉斯網絡分析(BNA)方法研究了多個環境變量的聯合效應。上述環境參數對空氣微生物豐度的影響在BNA中進行了建模(圖6)。這是在統計分析的基礎上進行的，強調了環境參數波動與微生物群落動態的一致性。此外，BNA模型評估了幾個場景，捕捉到了熱帶氣候中典型的一天。其中包括高溫場景(場景a)、低溫場景(場景B)以及強降雨場景(場景C)，這些場景描述了由局部雷暴引起的快速降溫和高溼度的影響。因此，BNA模型構建並可視化了各種環境因素與微生物相對豐度之間的概率相互作用的網絡(更詳細的描述見SI附錄)。
圖6 微生物類群和環境參數之間的概率相互作用的網絡。每個節點表示系統的一個變量，每條邊表示一個變量對另一個變量的影響。此外，每個節點都與一個概率表相關聯，該表指示在缺乏系統信息的情況下，變量處於特定狀態的可能性。一旦有關其他節點狀態的信息可用，每個節點的概率表就會更新(重新計算)。場景1模擬了一個典型的正午時間點，此時溫度達到最大值。為了應對高溫，我們重新計算了其他變量，做出了新的預測(例如，二氧化碳的含量可能很低，而細菌的相對豐度可能很高)。低溫場景2(典型的夜間場景)和場景3(典型的降雨場景)模擬了熱帶地區典型的局部氣象事件。
6.大氣顆粒物分布與環境汙染物
利用光學和掃描電子顯微鏡觀察不同形態和大小的生物和非生物顆粒(SI附錄，圖S13)。顆粒和微生物細胞分散分布，並沒有附著在基質上(SI附錄，圖S13A)。此外，從光學顆粒計數(OPCs)(SI附錄，圖S14)和收集的總生物量(如總提取DNA產量)(SI附錄，表S11)可以看出，不同粒徑之間並沒有明顯的相關性。顆粒大小與上述7個微生物類群的豐度也沒有相關性(SI附錄, 表S12)。用螢光和光學顯微鏡可以看到，有相當一部分的粒子屬於非生物物質(SI附錄, 圖S13B和D)。此外，多細胞生物，以及有一個或多個細胞核的單細胞生物也能夠被識別(SI附錄,圖S13B)。其中一些圖像似乎代表了子囊菌和擔子菌的真菌生活史的雙核階段(SI附錄，圖S13B)。作者還監測了環境汙染物的每小時濃度，如氮氧化物(NOx)和硫氧化物(SOx)，與報告的生物量波動和分類分布的關係。然而，這兩種化學物質都可以被排除在驅動空氣中微生物晝夜循環的因素之外(SI附錄,圖S15和S16)。
由於可獲得的生物量較少，因此對空氣樣本的宏基因組學分析在技術上具有挑戰性，因此以前僅限於長採樣時間間隔、大量空氣和使用基於擴增marker基因的研究方法。空氣中微生物的組成以前被認為是由於氣象、空間和時間因素的變化而不斷變化的。然而，作者在熱帶地區5個時間序列的採樣，跨度達13個月，得到了一個高度穩健的725個核心微生物類群。考慮到氣流的速度和季風在熱帶季節的相反方向，作者觀察到的熱帶空氣微生物群落的魯棒性是出乎意料的，特別是與溫帶氣候相比。然而，在白天和夜間的樣品中，微生物組成的變化很大，而不同日之間和和不同月之間的變化不太顯著(圖2和SI附錄，表S7)。通過高時間解析度對空中生物群落組成進行可靠的評估，甚至可以對極低的生物量環境進行調查，從而確定研究中相關生態系統(如大氣)的規模和邊界。未來對空氣微生物的源和匯的研究應當考慮晝夜之間的巨大分類學差異。因此，需要注意的是，在未來的研究中需要考慮一致的太陽仰角(真實太陽時間)，因為這些將控制最相關的環境參數，如溫度和相對溼度。從作者的宏基因組學研究中可以看到> 1200微生物類群在5個時間序列數據中的時間分布。儘管作者所觀察到的晝夜生物量波動的機制目前尚不清楚；但是生物顆粒（如孢子）的主動釋放，曾有過報導。此外，生物氣溶膠濃度的動態也可能受近地表大氣的氣象過程控制，如大氣水微滴的形成。
作者對熱帶空氣深入地分類學分析揭示了：空氣微生物與其他研究充分的生態系統(如海水、土壤和人類腸道)具有相似的複雜性。與其他生態系統相比，熱帶空氣中的真核微生物比例較高。真核生物中，擔子菌和子囊菌數量最多，而植物DNA含量較少。與海洋生態系統不同，空氣中只含有少量的噬菌體和古菌。雖然子囊菌科是自然界中最豐富的真菌門，且在溫帶氣候區空氣中分布廣泛，但擔子菌科在熱帶地區更為豐富(32)，儘管它們的時間分布和群落動態此前未知。
作者從全部序列數據的一小部分中觀察到的熱帶空氣微生物群落很高的多樣性，這特別值得注意。因為空氣生態系統在物種多樣性和豐富度上與海洋和土壤微生物群落相似，但是典型夜間樣本中只有9%的可注釋序列，日間樣本中有17%。在2小時間隔採樣時，空氣樣本中有超過400個物種，在5天的單一時間序列樣品中有超過1200個物種。
熱帶空氣微生物群落的動態和長期穩定可能受到環境因素的驅動，如溫度、相對溼度、降雨、太陽輻照度和二氧化碳水平。這些因素在每日重複的模式中變化，是全球尺度的熱帶空氣的典型特徵。重要的是，溫度被確定為驅動空氣微生物多樣性的最重要的環境參數，它還影響水汽壓(如相對溼度)。溫度同樣也是全球海洋系統微生物多樣性的驅動因素。熱帶地區高度一致的氣象條件是研究大氣近地表生態系統的理想條件，這一點可以從一個具有高時間和分類學解析度的單一地點長時間的數據集中得到證明。空氣微生物對溫度和二氧化碳波動的精確反應闡明了變化的環境因素是如何驅動生物氣溶膠動力學的。然而，生態系統響應的潛在機制目前尚不清楚。溫度作為主要的決定因素，以相反的方式影響細菌和真菌的分布，即在較高的溫度下細菌較多，真菌較少。另一個例子是E. lata和D. ampelina等微生物對降雨的反應。這些物種的豐富度的變化可能是由對當地環境的反應所驅動的，例如由溼度或降雨的變化所觸發的一種活躍機制使孢子霧化。有些物種對氣象變化的反應是一致的。芽孢桿菌KBS708和蝦青單胞菌豐度的變化表明溫度的變化，A. delicata和R. solani豐度的提高表明CO2水平的增加，而E. lata的豐度則與降雨有關。基於宏基因組學的高時間解析度和高靈敏性方法可以揭示這些對氣象條件的響應導致某些微生物的數量增加/減少了幾千倍(例如，圖5)。這種規模的物種豐富度的增加不太可能通過短時間內的生長來實現。這表明，至少對於本研究中描述的空氣菌群而言，某種形式的主動擴散機制正在發揮作用，其中許多機制在過去幾十年裡已被真菌學家闡明。相反，從空氣中去除生物量不需要依賴於一個主動的機制。因此，除了已知的通過幹沉積和溼沉積（例如在強降雨期間發生的衝刷）從大氣中去除氣溶膠的方法之外，作者提出了一種基於熱帶地區每日溫度波動的機制。這種機制是：當夜間溫度接近露點時，氣態水會形成納米水滴；這些納米液滴的形成，通過聚集成更大的液滴，可能有助於從近地表大氣中去除氣溶膠的溼沉積。此外，值得注意的是，大氣邊界層在夜間收縮，這也有助於夜間空中生物量的增加。有趣的是，OPC記錄的數據並不能體現出任何特定的顆粒大小與DNA的增加有關。因此，採樣中的大多數生物量可能是由不附著於特定基質的非聚集細胞組成的。這進而表明生物氣溶膠的聚集不是沉積過程中的主要因素。你可能還喜歡
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