限制性內切核酸酶的作用是在限制位點切割質粒分子自連接產生的環狀和線性多聯體。該方法需要質粒與靶DNA分子的連接破壞限制性酶切位點，以防止限制性內切核酸酶消化連接反應過程中產生的重組體。
單位長度線性載體分子持續再生的淨效應，推動連接反應的平衡狀態強烈偏向於載體和插入物之間形成重組體。
因為載體DNA的再生、連接、所有PCR產生的DNA片段的末端補平都同時發生在同一反應混合物中，該方法非常高效。
14 DNA理按酶3U調整H2O的加入量，使最終的反應體積為20μL°設置對照反應，包含.上述列出的所有試劑，除了擴增的靶DNA。
2.在22'C孵育連接混合物4h。限制性內切核酸酶切割質粒DNA:在dNTP的存在下，T4 DNA聚合酶的3外切核酸酶活性補平擴增的DNA的末端。
3.分別用10μL@ H2O稀釋5μL°兩種連接混合物，轉化合適的抗生素抗性的感受態大腸桿菌菌株(見信息欄「抗生素」)。根據載體和宿主基因型、IPTG 和X-Gal,將轉化培養物鋪在含有適當抗生素的培養基上(見第1章中信息欄「X-Gal」和方案14的信息欄「IPTG")。
4.計算從每個連接混合物得到的菌落數量。如果質粒可用於藍/白篩選，挑選- -些用含有靶DNA的連接反應產物轉化得到的白色菌落。在不同的實驗中，藍色：白色菌落的比率可以在1:5 到2:1之間變化。
5.通過分離重組質粒DNA，並用適當的限制性內切核酸酶消化確認擴增片段的存在。